微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作大全

1、微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū) 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書(shū)目 錄實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制實(shí)驗(yàn)二 消毒與滅菌實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡油浸系物鏡的使用實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌形態(tài)的觀(guān)察實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)六 放線(xiàn)菌的形態(tài)觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)八 霉菌的形態(tài)觀(guān)察 實(shí)驗(yàn)九 細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定(設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)十 微生物的接種方法實(shí)驗(yàn)一 培養(yǎng)基的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：學(xué)習(xí)和掌握配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟內(nèi)容：1、牛肉膏蛋白胨的配制2、高氏1號(hào)培養(yǎng)基的配制3、馬丁氏培養(yǎng)基的配制二、實(shí)驗(yàn)材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2H

2、PO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號(hào)筆、線(xiàn)繩、紗布三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普遍的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.47.61、稱(chēng)藥品 按實(shí)際用量計(jì)算后，按配方稱(chēng)取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水溶解后倒入大燒杯，牛肉膏極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。2、加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品

3、完全溶解后再補(bǔ)充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱(chēng)好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過(guò)程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補(bǔ)足所失水分。3、調(diào)pH 檢測(cè)培養(yǎng)基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，邊加邊攪拌，并隨時(shí)用pH試紙檢測(cè)，直至達(dá)到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/l HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。PH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應(yīng)注意pH值不可調(diào)過(guò)頭，以免調(diào)回影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度4、過(guò)濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過(guò)濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過(guò)濾，以利結(jié)果的觀(guān)察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可以省略。5、分裝 按實(shí)驗(yàn)要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶?jī)?nèi)。分裝時(shí)可用三角

4、漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶?jī)?nèi)以不超過(guò)其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法如圖11。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長(zhǎng)約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時(shí)也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層紙，以防滅菌時(shí)冷凝水沾濕棉塞。若培

5、養(yǎng)基分裝于試管中，則應(yīng)先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、組別、日期。8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應(yīng)放入冰箱內(nèi)暫存。9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長(zhǎng)木條上，并調(diào)整斜面，使斜面的長(zhǎng)度不超過(guò)試管總長(zhǎng)的1/2。10、無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用?；騼?chǔ)存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏一號(hào)培養(yǎng)基的配制高氏一號(hào)培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線(xiàn)菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g、NaCl 0.5g 、K2HPO4*3H2O 0.

6、5g、MgSO4*7H2O0.5g、 FeSO4*7H2O 0.01g，瓊脂1520g,水1000ml，pH7.47.6。1、稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加入至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO4*7H2O可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液再加入，方法是先在100ml中加入1g的FeSO4*7H2O，配成濃度為0.01g/ml的儲(chǔ)備液，再在1000ml培養(yǎng)基中加入以上儲(chǔ)備液1ml即可。待所有藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過(guò)程同牛肉膏蛋

7、白胨培養(yǎng)基配制。2、pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO41g、MgSO4*7H2O0.5g，蛋白胨5g，瓊脂1520g，水1000ml，自然pH。1、稱(chēng)量和溶解 先計(jì)算后稱(chēng)量，按用量先稱(chēng)取各成分，并將其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000ml培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3ml，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2、pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無(wú)菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制3、鏈霉素的加

8、入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時(shí)，將培養(yǎng)基融化后待溫度降低至45左右時(shí)才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于零下20），在100ml培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug。四、注意事項(xiàng)稱(chēng)藥品用的牛角匙不能混用；稱(chēng)完藥品應(yīng)及時(shí)蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時(shí)要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點(diǎn)，要注意具體操作。五、演示1、培養(yǎng)基的分裝方法2、試管斜面的擱置方法六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄本實(shí)驗(yàn)配制培養(yǎng)基的名稱(chēng)、數(shù)量，并圖解說(shuō)明其配制過(guò)程，指明要點(diǎn)。七、問(wèn)題與思考1、配制培養(yǎng)基有哪幾個(gè)步驟？在操作過(guò)程中應(yīng)注意些什么問(wèn)題？為什么？2、培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅

9、菌？若不能及時(shí)滅菌應(yīng)如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基如何進(jìn)行無(wú)菌檢查？3、試設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)飲料進(jìn)行無(wú)菌檢查實(shí)驗(yàn)二 消毒與滅菌一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解消毒和滅菌的原理,并掌握各種滅菌方法的操作步驟。內(nèi)容：1、高壓蒸汽滅菌法 2、干熱滅菌法 3、過(guò)濾除菌法二、實(shí)驗(yàn)材料和用具待滅菌的培養(yǎng)基和鏈霉素溶液手提式(或立式)高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過(guò)濾除菌器、培養(yǎng)皿、試管。三、操作步驟（一）高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無(wú)菌水、工作服等物品的滅菌。1、加水 將高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)桶取出,外桶內(nèi)加水與三角架平。2、裝料 裝待滅菌物品,瓶塞不要緊靠桶壁,防冷凝水濕棉塞。3、加蓋 將排氣軟管插入內(nèi)桶排氣槽內(nèi),對(duì)

10、齊螺口,同時(shí)擰緊。并打開(kāi)排氣閥。4、排氣 排出的氣流很強(qiáng)時(shí),表明鍋內(nèi)空氣已排盡(約5分鐘) 。(開(kāi)關(guān).壓力控制旋鈕)5、升壓 鍋內(nèi)空氣排盡時(shí), 關(guān)閉排氣閥,開(kāi)始升壓。6、保壓 壓力表達(dá)所需壓力時(shí),控制熱源,開(kāi)始計(jì)時(shí)并維持壓力,本實(shí)驗(yàn)用 121 (98kPa. 1.05kg/cm2), 20min滅菌。7、降壓 達(dá)所需(20min)時(shí)間,關(guān)閉熱源,自然降壓到 0 , 打開(kāi)排氣閥,放凈余氣,開(kāi)蓋取物放凈余水。8、無(wú)菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無(wú)菌生長(zhǎng)即可使用。（二）干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿,如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶等物品的滅菌。1、裝入待滅菌物品 預(yù)先用紙或金屬盒筒

11、裝好待滅菌物品,放入電熱烘箱內(nèi)。 2、升溫 關(guān)門(mén)通電,旋動(dòng)恒溫調(diào)節(jié)器至所需溫度(本實(shí)驗(yàn)所需溫度 160-170),烘箱紅燈亮示加熱,綠燈亮示停止加溫。3、恒溫 維持 2 h。4、降溫 斷電自然降溫。 5、取出滅菌物品 溫降至 70 以下時(shí)開(kāi)門(mén)取物。（三）過(guò)濾除菌法過(guò)濾除菌法適用于易受熱分解的材料,如抗生素、血清、維生素等的除菌。如濾膜過(guò)濾器、蔡氏濾器、玻璃濾器過(guò)濾等。四、注意事項(xiàng)1、高壓蒸汽滅菌要按程序操作,不能離開(kāi),壓力降至 0 時(shí)開(kāi)蓋。2、干熱滅菌物品不能太擠,物品不要與壁板接觸,以免烤焦。3、過(guò)濾除菌的各連接處要結(jié)合緊密,以防污染。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件

12、(溫、壓等)。2、試述高壓蒸汽滅菌的操作過(guò)程及注意事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)三 顯微鏡油浸系物鏡的使用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)內(nèi)容目的：復(fù)習(xí)顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術(shù)，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法內(nèi)容：1、學(xué)習(xí)油浸系物鏡的使用方法2、用油鏡觀(guān)察細(xì)菌三型和放線(xiàn)菌染色裝片二、實(shí)驗(yàn)材料和用具細(xì)菌三型、放線(xiàn)菌的染色裝片，香柏油、二甲苯，顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟（一）觀(guān)察前的準(zhǔn)備1、將顯微鏡置于平穩(wěn)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，鏡座距離實(shí)驗(yàn)臺(tái)邊沿約4厘米。坐正，練習(xí)用左眼觀(guān)察。2、調(diào)節(jié)光源：將低倍鏡轉(zhuǎn)到工作位置，將光圈完全打開(kāi)，聚光器升至與載物臺(tái)相距約一微米左右。轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡采集光源，光線(xiàn)較強(qiáng)的天然光源宜用平面鏡，

13、光線(xiàn)較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對(duì)光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀(guān)察染色裝片時(shí)，光線(xiàn)宜強(qiáng)；觀(guān)察未染色裝片時(shí)，光線(xiàn)不宜太強(qiáng)。（二）低倍鏡觀(guān)察染色裝片首先上升鏡筒，將細(xì)菌三型染色裝片置于載物臺(tái)上，用標(biāo)本夾夾住，將觀(guān)察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距離裝片0.5厘米處，適當(dāng)縮小光圈然后兩眼從目鏡觀(guān)察，轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器使物鏡逐漸上升（或使鏡臺(tái)下降）至發(fā)現(xiàn)物象時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物象清楚為止。移動(dòng)裝片，把合適的觀(guān)察部位移至視野中心。（三）高倍鏡觀(guān)察眼睛離開(kāi)目鏡從側(cè)面觀(guān)察，旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)換器，將高倍鏡轉(zhuǎn)至正下方，注意避免鏡頭與玻片相撞。再由目鏡觀(guān)察，仔細(xì)調(diào)節(jié)光圈，使光線(xiàn)的明亮度適宜。用細(xì)調(diào)節(jié)器校正焦距使物象清晰為止

14、。將最適宜觀(guān)察部位移至視野中心，繪圖。不要移動(dòng)裝片位置，準(zhǔn)備用油鏡觀(guān)察。（四）油鏡觀(guān)察1、提起鏡筒約2厘米，將油鏡轉(zhuǎn)至正下方。在玻片標(biāo)本的鏡檢部位（鏡頭的正下方）滴一滴香柏油。2、從側(cè)面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴(kuò)散為止，鏡頭幾乎與玻片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3、將光圈調(diào)亮，左眼從目鏡觀(guān)察，用粗調(diào)節(jié)器將鏡筒徐徐上升（切忌反放向旋轉(zhuǎn)），當(dāng)視野中出現(xiàn)物象時(shí)，改用細(xì)調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)到物象清楚為止。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快未找到物象，必須再?gòu)膫?cè)面觀(guān)察，將油鏡降下，重復(fù)操作直至物象看清為止。仔細(xì)觀(guān)察并繪圖。4、再次觀(guān)察 提起鏡筒，換上放線(xiàn)菌染色裝片，依次用低倍

15、鏡、高倍鏡和油鏡觀(guān)察，繪圖。重復(fù)觀(guān)察時(shí)可比第一次少加香柏油。（五）鏡檢完畢后的工作1、 提起鏡筒，或降下載物臺(tái)2、 移開(kāi)物鏡鏡頭3、 取出裝片4、 清潔油鏡 油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。5、 擦凈顯微鏡，將各部分還原。將物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對(duì)聚光器，同時(shí)降下聚光器，轉(zhuǎn)動(dòng)反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對(duì)號(hào)放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。四、注意事項(xiàng)1、使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀(guān)察，再用油鏡觀(guān)察的程序操作。2、下降鏡頭時(shí)，一定要從側(cè)面注視，切忌用眼睛對(duì)著目鏡，邊觀(guān)察邊下降鏡頭

16、的錯(cuò)誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3、使用二甲苯擦鏡頭時(shí)，注意二甲苯不能過(guò)多，以防溶解固定透鏡的樹(shù)脂。4、注意保持顯微鏡的潔凈，對(duì)金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、演示如何使用油鏡觀(guān)察染色裝片的要點(diǎn)，如滴油、下降鏡頭、調(diào)焦、擦拭鏡頭等六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀(guān)察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率七、問(wèn)題和思考1、用油鏡便于觀(guān)察細(xì)菌的依據(jù)是什么？2、使用油鏡應(yīng)特別注意哪些問(wèn)題？3、當(dāng)物鏡從低倍鏡轉(zhuǎn)換到高倍鏡和油鏡時(shí)，對(duì)照明度有何要求？應(yīng)如何調(diào)節(jié)？實(shí)驗(yàn)四 細(xì)菌形態(tài)的觀(guān)察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛯?shí)驗(yàn)內(nèi)容目的：鞏固

17、油鏡的使用；掌握細(xì)菌形態(tài)觀(guān)察的基本方法，了解細(xì)菌的基本形態(tài)內(nèi)容：1、觀(guān)察細(xì)菌的基本形態(tài)染色裝片2、觀(guān)察枯草芽孢桿菌活菌3、觀(guān)察細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的染色裝片二、實(shí)驗(yàn)材料和用具大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌；變形菌裝片三、操作步驟（一）、觀(guān)察細(xì)菌的基本形態(tài)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀(guān)察大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖（二）、觀(guān)察枯草桿菌活菌(常用壓滴法)：1、 將潔凈無(wú)油膩的載片放于自己正前方，在中央放一滴無(wú)菌水2、 將酒精燈放于自己正前方，點(diǎn)燃3、 用無(wú)菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的隨地充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架4、

18、 用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個(gè)蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過(guò)多，可用吸水紙吸去一部分。5、 先用低倍鏡然后轉(zhuǎn)用高倍鏡觀(guān)察，觀(guān)察時(shí)光線(xiàn)要適當(dāng)調(diào)暗一些。四、注意事項(xiàng)1、 注意擦鏡頭時(shí)，只能用擦鏡紙2、 觀(guān)察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片，放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作，不能在油鏡下直接取下和替換裝片3、 無(wú)菌操作過(guò)程中，接種環(huán)美軍后不能觸及其他物品，挑菌不能過(guò)多五、演示1、 細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)裝片示范鏡2、 無(wú)菌操作過(guò)程3怎樣蓋蓋玻片才不產(chǎn)生氣泡。 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一) 繪圖1 繪出你所觀(guān)察到的幾種細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)視野圖2 繪出你所觀(guān)察到的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)視

19、野圖，并注明各部分(二) 試指出在制備活菌裝片時(shí)，應(yīng)注意什么問(wèn)題?七、 問(wèn)題與思考1用明視野顯微鏡觀(guān)察細(xì)菌的形態(tài)時(shí)，你認(rèn)為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀(guān)察活體裝片與染色裝片，光線(xiàn)調(diào)節(jié)各有什么不同?2無(wú)菌操作過(guò)程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?實(shí)驗(yàn)五 細(xì)菌的革蘭氏染色一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 目的：初步掌握細(xì)菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟內(nèi)容：1制作細(xì)菌染色裝片。2進(jìn)行革蘭氏染色法操作二、 實(shí)驗(yàn)材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Ecoli)菌液，待測(cè)菌菌液12種。革蘭氏染色液(結(jié)晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復(fù)紅液等)、香柏油

20、、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、試管、小滴管三、 操作步驟（一）制片1涂菌 用無(wú)菌操作方法從試管中沽取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無(wú)脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌2干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過(guò)高)。3固定 目的是殺死細(xì)菌并使細(xì)菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細(xì)菌涂片膜向上，通過(guò)火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色 1初染 于制片上滴加結(jié)晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2媒染 滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。 3脫色 滴加95乙醇

21、脫色，搖動(dòng)玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚度需時(shí)30s至lmin)，水洗。 4復(fù)染 滴加石炭酸復(fù)紅液復(fù)染1min，水洗。 5用濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結(jié)果 革蘭氏陽(yáng)性菌染成藍(lán)紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。(四)檢測(cè)未知菌用以上方法對(duì)未知菌進(jìn)行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結(jié)果。四、注意事項(xiàng) 1涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚。 2在染色過(guò)程中，不可使染液干涸。 3脫色時(shí)間十分重要，過(guò)長(zhǎng)，則脫色過(guò)度，會(huì)使陽(yáng)性菌被染成陰性菌。4老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會(huì)使陽(yáng)性菌被染成陰性菌，故不能選用。五、演示制片方法及染色過(guò)程。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 (一)繪圖 1大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。 2金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野

22、圖。 (二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進(jìn)行結(jié)果分析。（三）未知菌的檢測(cè)結(jié)果。七、問(wèn)題和思考 1涂片后為什么要進(jìn)行固定?固定時(shí)應(yīng)注意什么? 2什么是革蘭氏染色法?染色過(guò)程應(yīng)注意什么? 3試分析革蘭氏染色法在細(xì)菌分類(lèi)中的意義。 實(shí)驗(yàn)六 放線(xiàn)菌的形態(tài)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：辨認(rèn)放線(xiàn)菌的營(yíng)養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學(xué)習(xí)放線(xiàn)菌的觀(guān)察方法 內(nèi)容：用水封片法、玻璃紙法、印片法觀(guān)察放線(xiàn)菌的形態(tài)特征，二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 細(xì)黃鏈霉菌(Streptornyces micuoflavus)又稱(chēng)5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospra echinospora)的玻璃紙培養(yǎng)子皿。0

23、1美藍(lán)染色液、石炭酸復(fù)紅染色液、蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器三、操作步驟(一) 觀(guān)察自然生長(zhǎng)狀態(tài)的放線(xiàn)菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長(zhǎng)有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀(guān)察。找出3類(lèi)菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線(xiàn)菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)和色澤差異。（二）水封片觀(guān)察取一滴美藍(lán)染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀(guān)察其單個(gè)分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖（三）玻璃紙法的鏡檢觀(guān)察1、直接玻

24、璃紙觀(guān)察 分別用5406和棘轉(zhuǎn)孢小單孢菌的玻璃紙制片觀(guān)察。制片時(shí)，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響觀(guān)察。將制片于顯微鏡下觀(guān)察，先用低倍鏡觀(guān)察菌的立體生長(zhǎng)狀況，再用高倍鏡仔細(xì)觀(guān)察。注意區(qū)分5406菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲觀(guān)察棘孢小單孢菌時(shí)注意把視野調(diào)暗，其基內(nèi)菌絲纖細(xì)發(fā)亮，其單個(gè)分生孢子發(fā)暗，直接生長(zhǎng)在基內(nèi)菌絲長(zhǎng)出的小梗上。繪圖2、印片染色法觀(guān)察 用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長(zhǎng)有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片

25、水平移動(dòng)而破壞放線(xiàn)菌的自然形態(tài)。反轉(zhuǎn)有印痕的載玻片微微加熱固定，用石炭酸復(fù)紅染色lmin，水洗，晾干用油鏡觀(guān)察。繪圖。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。四、注意事項(xiàng)1、培養(yǎng)放線(xiàn)菌中要注意，放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)速度較慢，培養(yǎng)期較長(zhǎng)，在操作中應(yīng)特別注意無(wú)菌操作，嚴(yán)防雜菌污染2玻璃紙法培養(yǎng)接種時(shí)注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)3不同觀(guān)察方法中嚴(yán)格按要求進(jìn)行，注意菌體的上下位置五、演示1. 幾種不同的培養(yǎng)方法。2. 幾種觀(guān)察方法的要點(diǎn)和注意事項(xiàng)3. 5406菌及棘孢小單孢菌形態(tài)的示范鏡。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1、繪圖 玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長(zhǎng)狀態(tài)下觀(guān)察的放線(xiàn)菌形態(tài)2、試比較

26、5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同七、問(wèn)題和思考1、在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線(xiàn)菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2、用插片法和搭片法如何制備放線(xiàn)菌標(biāo)本，其主要優(yōu)點(diǎn)是什么?可否用此法觀(guān)察其他微生物？為什么？注： (一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線(xiàn)菌 1插片法 (1)制平板、接種：用冷卻至約50的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法A先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來(lái)回劃線(xiàn)接種（接種量可適當(dāng)加大）。B先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進(jìn)行。 (2)插片及培養(yǎng)：用無(wú)菌鑷子取無(wú)菌蓋玻片，在已接種平板上以45角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插入深度約占蓋玻

27、片12長(zhǎng)度。同時(shí)，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5460菌孢子至蓋玻片一側(cè)的基部，且僅接種于其中央位置約占蓋玻片長(zhǎng)度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側(cè)。將插片平板倒置于28，培養(yǎng)37d2搭片法(1)開(kāi)槽及接種：用無(wú)菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個(gè)，并將棘孢小單孢菌孢子劃線(xiàn)接種到洞內(nèi)邊緣。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無(wú)菌蓋玻片。平板倒置于28，培養(yǎng)37d。(二)玻璃紙法固體培養(yǎng)5406菌和棘孢小單孢菌 1玻璃紙滅菌 將玻璃紙剪成比培養(yǎng)皿直徑略小的片狀，將濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片并稍潤(rùn)濕，然后把濕濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中，借濾紙將玻

28、璃紙隔開(kāi)。然后進(jìn)行濕熱滅菌，備用。 2制平板及鋪玻璃紙 取冷凝后的高氏1號(hào)瓊脂培養(yǎng)基，用無(wú)菌鑷子將預(yù)先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)基表面，鋪玻璃紙時(shí)可用無(wú)菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基間的氣泡除去。3涂布菌液及培養(yǎng) 取01mL的孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養(yǎng)基表面。接種平板倒置于28，培養(yǎng)57d。實(shí)驗(yàn)七 酵母菌的形態(tài)觀(guān)察實(shí)驗(yàn)一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容：目的：了解自然存在的酵母菌及其形態(tài)結(jié)構(gòu)。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)內(nèi)容：1觀(guān)察酵母菌個(gè)體形態(tài)。 2觀(guān)察酵母菌的假菌絲和繁殖過(guò)程。3觀(guān)察自然狀態(tài)的酵母菌。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、熱帶假絲

29、酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。 PDA培養(yǎng)基、麥?zhǔn)?McCLary)培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基)、005美藍(lán)染色液(以pH 60的002molL磷酸緩沖液配制)、碘液、004的中性紅染色液、5孔雀綠，05沙黃液、95乙醇。顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個(gè)三角形玻璃棒支架的培養(yǎng)皿。三、操作步驟 (一)酵母菌形態(tài)觀(guān)察1酵母菌的活體染色觀(guān)察及死亡率的測(cè)定(1)以無(wú)菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。(2)取005美藍(lán)染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色23min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀(guān)察酵母菌個(gè)體形態(tài)，區(qū)分其母

30、細(xì)胞與芽體，區(qū)分死細(xì)胞(藍(lán)色)與活細(xì)胞(不著色)。(3)在一個(gè)視野里計(jì)數(shù)死細(xì)胞和活細(xì)胞，共計(jì)數(shù)56個(gè)視野。 酵母菌死亡率一般用百分?jǐn)?shù)來(lái)表示，以下式來(lái)計(jì)算： 死亡率=死細(xì)胞總數(shù)/死活細(xì)胞總數(shù)（%）2酵母菌液泡系的活體觀(guān)察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀(guān)察。細(xì)胞無(wú)色，液泡呈紅色。3酵母菌細(xì)胞中肝糖粒的觀(guān)察 將1滴碘液置于載玻片中央，接入上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀(guān)察，細(xì)胞內(nèi)的貯藏物質(zhì)肝糖顆粒呈深紅色。4酵母菌子囊孢子的觀(guān)察 (1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，置28C培養(yǎng)23d，然后再移植23

31、次。 (2)移接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀灑酵母移接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30C恒溫培養(yǎng)14d。 (3)觀(guān)察：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，lmin后水洗，加95乙醇30s，水洗，最后用o5沙黃液復(fù)染30s，水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀(guān)察子囊孢子的數(shù)目、形狀和子囊的形成率。 (4)計(jì)算子囊形成的百分率：計(jì)數(shù)時(shí)隨機(jī)取3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細(xì)胞，然后按下列公式計(jì)算： 子囊形成率() 三個(gè)視野中形成子囊的總數(shù)/三個(gè)視野中（形成子囊的總數(shù)加不產(chǎn)豹子細(xì)胞總數(shù)） XlOO5酵母菌假菌絲的觀(guān)察

32、取一無(wú)菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在濕室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進(jìn)行酵母菌劃線(xiàn)接種，然后將無(wú)菌蓋玻片蓋在接菌線(xiàn)上，28培養(yǎng)23d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀(guān)察?？梢?jiàn)到芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲。6自然狀態(tài)下的酵母菌觀(guān)察 取一滴美藍(lán)染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細(xì)觀(guān)察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。 四、注意事項(xiàng)1、用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤(rùn)。2、在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率。3、通過(guò)微加熱增加酵母的死

33、亡率，易于觀(guān)察死亡細(xì)胞。五、演示1酵母菌子囊及子囊孢子，酵母菌假菌絲的示范鏡。2假菌絲培養(yǎng)的操作過(guò)程。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪圖1數(shù)個(gè)酵母菌細(xì)胞，示觀(guān)察到的結(jié)構(gòu)。2數(shù)個(gè)子囊及子囊孢子形態(tài)圖。(二)記錄并計(jì)數(shù)酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計(jì)算結(jié)果)。七、問(wèn)題和思考 1酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2如何區(qū)別營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和釋放出的子囊孢子?3試設(shè)計(jì)一個(gè)從子囊中分離子囊孢子的試驗(yàn)方案。注： 酵母菌的簡(jiǎn)易培養(yǎng) 配2葡萄糖水(或白糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度23cm)，加HCl調(diào)至pH34，放人幾塊葡萄皮(或其他糖分較高的果皮)，置2528溫箱中培養(yǎng)2-3d，聞到酒香味后，

34、即可取培養(yǎng)液鏡檢。實(shí)驗(yàn)八 霉菌的形態(tài)觀(guān)察一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容目的：了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。內(nèi)容：1霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。 2曲霉、青霉、根霉、毛霉形態(tài)觀(guān)察。3根霉假根的觀(guān)察。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、黑根霉、總狀毛霉等斜面菌種。 半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍(lán)染色液、20甘油。 透明膠帶、剪刀、培養(yǎng)皿、門(mén)形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細(xì)口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、吸水紙等三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。1準(zhǔn)備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“門(mén)”形載玻片擱架，在擱架上放

35、一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)121濕熱滅菌30min后，置60烘箱中烘干，備用。2取菌接種 用接種環(huán)挑取少量待觀(guān)察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時(shí)只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務(wù)必記住接種的位置)。3加培養(yǎng)基 用無(wú)菌細(xì)口滴管吸取少量融化約60的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應(yīng)滴得圓而薄，其直徑約為05cm(滴加量一般以1Q小滴為宜)。4。加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固前，用無(wú)菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上、用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當(dāng)接近，但不能壓扁，否則不透氣。5倒保濕劑 每皿倒人約3mL20的無(wú)菌甘

36、油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤(rùn)濕，以保持皿內(nèi)濕度。皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28C恒溫培養(yǎng)35de(二)黑根霉假根的培養(yǎng) 將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50C倒入無(wú)菌平皿，其量約為平皿高度的1超。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在乎板表面劃線(xiàn)接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無(wú)菌載玻片，于28培養(yǎng)23d后，可見(jiàn)根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結(jié)構(gòu)。(三)鏡檢觀(guān)察 1濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片 從培養(yǎng)1620h開(kāi)始，通過(guò)連續(xù)觀(guān)察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長(zhǎng)分化和子實(shí)體的形成過(guò)程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下

37、觀(guān)察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點(diǎn)觀(guān)察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點(diǎn)，曲霉的足細(xì)胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。 2粘片觀(guān)察 取一滴棉藍(lán)染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開(kāi)霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。 3假根觀(guān)察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開(kāi)，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標(biāo)本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀(guān)察。只要用低倍鏡就能觀(guān)察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個(gè)假根間的匍匐菌絲，觀(guān)察時(shí)注意調(diào)節(jié)焦距以看清各種構(gòu)造。 4制成永久裝片 把觀(guān)察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標(biāo)本作較長(zhǎng)期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻

38、片，如果載玻片上有瓊脂，仔細(xì)挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹(shù)膠封固。 四、注意事項(xiàng) 載玻片濕室培養(yǎng)時(shí)，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分 結(jié)構(gòu)平行排列，易于觀(guān)察。五、演示 14種霉菌制片的示范。 2載玻片濕室培養(yǎng)方法。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖 1、 毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部2、 青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀(guān)察紀(jì)錄各菌種的載玻片標(biāo)本觀(guān)察結(jié)果菌種菌絲體（氣生菌絲、營(yíng)養(yǎng)菌絲的粗細(xì)、色澤，菌絲有隔或無(wú)隔等）無(wú)性菌絲特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結(jié)構(gòu)（有無(wú)假根、足細(xì)胞、匍匐菌絲、囊軸等七、問(wèn)題和思考1

39、、 什么叫載玻片濕室培養(yǎng)？它適用于觀(guān)察什么樣的微生物，有何優(yōu)點(diǎn)？2、 濕室培養(yǎng)時(shí)為何用20%甘油作保濕劑？3、 本實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察假根的設(shè)計(jì)原理是什么？此設(shè)計(jì)還適用于培養(yǎng)那些菌？實(shí)驗(yàn)九 細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定(設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn))-計(jì)數(shù)市售酸奶或口服液或菌肥制品的單位含菌數(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 目的：掌握細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法。 內(nèi)容：1計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)。 2載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù)。 3平板菌落計(jì)數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)方案自行設(shè)計(jì)三、實(shí)驗(yàn)材料 市場(chǎng)采集四、用具顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、酒精燈、無(wú)菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無(wú)菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡紙、無(wú)菌試管、涂布器、無(wú)菌培養(yǎng)皿等。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 (一)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果(二

40、)比較以上3種不同計(jì)數(shù)方法所得的結(jié)果并進(jìn)行分析。附:細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定(實(shí)驗(yàn)參考)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容 目的：掌握細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法。 內(nèi)容：1計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù)。 2載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù)。 3平板菌落計(jì)數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)斜面培養(yǎng)物(約培養(yǎng)l0h)、培養(yǎng)57d的大腸桿菌(Ecoli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、美藍(lán)染色液、結(jié)晶紫染色液、香柏油、二甲苯、無(wú)菌水。 顯微鏡、血細(xì)胞計(jì)數(shù)板、手動(dòng)計(jì)數(shù)器、酒精燈、無(wú)菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無(wú)菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡低、無(wú)菌試管、涂布器、無(wú)菌培養(yǎng)皿。三、操作步驟(一)計(jì)數(shù)板直接鏡檢計(jì)數(shù) 1血細(xì)胞計(jì)數(shù)

41、板的構(gòu)造血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由四條平行槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)，中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺(tái)面各有一個(gè)含9個(gè)大格的方格網(wǎng)，中間大格為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的長(zhǎng)和寬各為lmm，中間平臺(tái)下陷01mm，故蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的容積為01mm3。血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造見(jiàn)圖16。常見(jiàn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是16X 25型，稱(chēng)為麥?zhǔn)涎?xì)胞計(jì)數(shù)板，共有16個(gè)中格，每個(gè)中格分為25個(gè)小格。另一種是25X16型，稱(chēng)為希里格式血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，共有25個(gè)中格，每個(gè)中格又分成16個(gè)小格。但是不管哪種規(guī)格的血細(xì)胞計(jì)板其計(jì)數(shù)室的小格均由400個(gè)小方格組成。應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)算微生物細(xì)胞的數(shù)量，方法是先測(cè)定

42、若干個(gè)方格中的微生物細(xì)胞，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細(xì)胞數(shù)量。 2細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 (1)稀釋加樣；取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至100mL無(wú)菌水中，稀釋混勻后待用(濃度約為104105mL)。先將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲入，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細(xì)菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部，將計(jì)數(shù)板放于載物臺(tái)的中央，按下列步驟尋找計(jì)數(shù)室并計(jì)數(shù)。 (2)找計(jì)數(shù)室：先在低倍鏡下尋找計(jì)數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉(zhuǎn)換高倍鏡后，調(diào)節(jié)光亮度至菌體和計(jì)數(shù)室線(xiàn)條清晰為止，再將計(jì)數(shù)室一角的小格移至視野中。順著大方格線(xiàn)移動(dòng)計(jì)數(shù)板，使計(jì)數(shù)室位于視野中間。 (3)計(jì)數(shù)：計(jì)

43、數(shù)時(shí)，如用16X25型計(jì)數(shù)板則按對(duì)角線(xiàn)方位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)大格(共4個(gè)大格，100個(gè)小格)內(nèi)的細(xì)胞逐一進(jìn)行計(jì)數(shù)；如使用規(guī)格為25X16型的計(jì)數(shù)板，則除取左上、右上、左下、右下4個(gè)大格外，還需加中央的一個(gè)大格(共5個(gè)大格，80個(gè)小格)內(nèi)的細(xì)胞。計(jì)數(shù)時(shí)當(dāng)遇到大格線(xiàn)上的細(xì)菌時(shí)，一般只計(jì)此大格的上方及右方線(xiàn)上的細(xì)胞(或只計(jì)下方及左方線(xiàn)上的細(xì)胞)，將計(jì)得的細(xì)胞數(shù)填入結(jié)果表中，對(duì)每個(gè)樣品重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取其平均值，按下列公式計(jì)算每mL菌液中所含的細(xì)菌細(xì)胞數(shù)。16X25和25X16型血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的計(jì)算公式(二)載玻片直接鏡檢計(jì)數(shù) 1搖動(dòng)菌液使其混合均勻，用無(wú)菌微量移液管取菌液001mL于載玻片上，并用無(wú)菌接種環(huán)均勻地涂布在1cm2的面積上。風(fēng)干，固定，結(jié)晶紫染色1min，沖洗，干燥備用。 2用物鏡測(cè)微尺，測(cè)量顯微鏡油鏡觀(guān)察時(shí)的視野直徑，并以S=r2公式，計(jì)算出視野面積。 3將涂片置于載物臺(tái)，滴香柏油，以油鏡觀(guān)察，不斷變化視野，共觀(guān)察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每一視野中細(xì)菌個(gè)數(shù)。以下列公式計(jì)算每毫升菌液中的含菌數(shù)量。(三)平板菌落計(jì)數(shù) 另取滅菌移液管