微生物學實驗操作大全

1、微生物學實驗指導書 微生物學實驗指導書目 錄實驗一 培養(yǎng)基的配制實驗二 消毒與滅菌實驗三 顯微鏡油浸系物鏡的使用實驗四 細菌形態(tài)的觀察實驗五 細菌的革蘭氏染色實驗六 放線菌的形態(tài)觀察 實驗七 酵母菌的形態(tài)觀察 實驗八 霉菌的形態(tài)觀察 實驗九 細菌數(shù)量的測定(設計性實驗)實驗十 微生物的接種方法實驗一 培養(yǎng)基的配制一、實驗目的和內(nèi)容目的：學習和掌握配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟內(nèi)容：1、牛肉膏蛋白胨的配制2、高氏1號培養(yǎng)基的配制3、馬丁氏培養(yǎng)基的配制二、實驗材料和用具牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/l NaOH、1mol/l HCl、KNO3、NaCl 、K2H

2、PO4*3H2O、MgSO4*7H2O、 FeSO4*7H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普遍的細菌基礎培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂1520g，水1000ml，pH7.47.61、稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯，牛肉膏極易吸潮，故稱量時要迅速。2、加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品

3、完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失水分。3、調pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若偏酸，可滴加1mol/l NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用1mol/l HCl進行調節(jié)。PH的調節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不可調過頭，以免調回影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度4、過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利結果的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可以省略。5、分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角

4、漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的1/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脫脂棉）制作的棉塞，棉塞制作方法如圖11。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培

5、養(yǎng)基分裝于試管中，則應先把試管扎成捆后，再于棉塞外包一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min。如因特殊情況不能及時滅菌，則應放入冰箱內(nèi)暫存。9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調整斜面，使斜面的長度不超過試管總長的1/2。10、無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用。或儲存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏一號培養(yǎng)基的配制高氏一號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g、NaCl 0.5g 、K2HPO4*3H2O 0.

6、5g、MgSO4*7H2O0.5g、 FeSO4*7H2O 0.01g，瓊脂1520g,水1000ml，pH7.47.6。1、稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒杯中，并用少量冷水將其調成糊狀，再加入至少于所需水量的沸水中，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對微量成分FeSO4*7H2O可先配制成高濃度的儲備液再加入，方法是先在100ml中加入1g的FeSO4*7H2O，配成濃度為0.01g/ml的儲備液，再在1000ml培養(yǎng)基中加入以上儲備液1ml即可。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋

7、白胨培養(yǎng)基配制。2、pH調節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO41g、MgSO4*7H2O0.5g，蛋白胨5g，瓊脂1520g，水1000ml，自然pH。1、稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取各成分，并將其溶解在少于所需量的水中。待各成分完全溶解后，補充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000ml培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3ml，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2、pH調節(jié)、分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制3、鏈霉素的加

8、入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化后待溫度降低至45左右時才能加入?？上葘㈡溍顾嘏涑?%的溶液（配好的鏈霉素溶液保存于零下20），在100ml培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3ml，使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素30ug。四、注意事項稱藥品用的牛角匙不能混用；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。調pH時要小心操作，避免回調。不同培養(yǎng)基各有配制特點，要注意具體操作。五、演示1、培養(yǎng)基的分裝方法2、試管斜面的擱置方法六、實驗報告記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點。七、問題與思考1、配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟？在操作過程中應注意些什么問題？為什么？2、培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅

9、菌？若不能及時滅菌應如何處理？已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查？3、試設計實驗對飲料進行無菌檢查實驗二 消毒與滅菌一、實驗目的和內(nèi)容目的：了解消毒和滅菌的原理,并掌握各種滅菌方法的操作步驟。內(nèi)容：1、高壓蒸汽滅菌法 2、干熱滅菌法 3、過濾除菌法二、實驗材料和用具待滅菌的培養(yǎng)基和鏈霉素溶液手提式(或立式)高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、過濾除菌器、培養(yǎng)皿、試管。三、操作步驟（一）高壓蒸汽滅菌法高壓蒸汽滅菌法適用于培養(yǎng)基、無菌水、工作服等物品的滅菌。1、加水 將高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)桶取出,外桶內(nèi)加水與三角架平。2、裝料 裝待滅菌物品,瓶塞不要緊靠桶壁,防冷凝水濕棉塞。3、加蓋 將排氣軟管插入內(nèi)桶排氣槽內(nèi),對

10、齊螺口,同時擰緊。并打開排氣閥。4、排氣 排出的氣流很強時,表明鍋內(nèi)空氣已排盡(約5分鐘) 。(開關.壓力控制旋鈕)5、升壓 鍋內(nèi)空氣排盡時, 關閉排氣閥,開始升壓。6、保壓 壓力表達所需壓力時,控制熱源,開始計時并維持壓力,本實驗用 121 (98kPa. 1.05kg/cm2), 20min滅菌。7、降壓 達所需(20min)時間,關閉熱源,自然降壓到 0 , 打開排氣閥,放凈余氣,開蓋取物放凈余水。8、無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用。（二）干熱滅菌法干熱滅菌法適用于玻璃器皿,如試管、培養(yǎng)皿、三角瓶等物品的滅菌。1、裝入待滅菌物品 預先用紙或金屬盒筒

11、裝好待滅菌物品,放入電熱烘箱內(nèi)。 2、升溫 關門通電,旋動恒溫調節(jié)器至所需溫度(本實驗所需溫度 160-170),烘箱紅燈亮示加熱,綠燈亮示停止加溫。3、恒溫 維持 2 h。4、降溫 斷電自然降溫。 5、取出滅菌物品 溫降至 70 以下時開門取物。（三）過濾除菌法過濾除菌法適用于易受熱分解的材料,如抗生素、血清、維生素等的除菌。如濾膜過濾器、蔡氏濾器、玻璃濾器過濾等。四、注意事項1、高壓蒸汽滅菌要按程序操作,不能離開,壓力降至 0 時開蓋。2、干熱滅菌物品不能太擠,物品不要與壁板接觸,以免烤焦。3、過濾除菌的各連接處要結合緊密,以防污染。五、實驗報告1、記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件

12、(溫、壓等)。2、試述高壓蒸汽滅菌的操作過程及注意事項。實驗三 顯微鏡油浸系物鏡的使用一、實驗目的和實驗內(nèi)容目的：復習顯微鏡低倍鏡和高倍鏡的使用技術，了解油浸系物鏡的基本原理，掌握油浸系物鏡的使用方法內(nèi)容：1、學習油浸系物鏡的使用方法2、用油鏡觀察細菌三型和放線菌染色裝片二、實驗材料和用具細菌三型、放線菌的染色裝片，香柏油、二甲苯，顯微鏡、擦鏡紙。三、操作步驟（一）觀察前的準備1、將顯微鏡置于平穩(wěn)的實驗臺上，鏡座距離實驗臺邊沿約4厘米。坐正，練習用左眼觀察。2、調節(jié)光源：將低倍鏡轉到工作位置，將光圈完全打開，聚光器升至與載物臺相距約一微米左右。轉動反光鏡采集光源，光線較強的天然光源宜用平面鏡，

13、光線較弱的天然光源或人工光源宜用凹面鏡，對光至視野內(nèi)均勻明亮為止。觀察染色裝片時，光線宜強；觀察未染色裝片時，光線不宜太強。（二）低倍鏡觀察染色裝片首先上升鏡筒，將細菌三型染色裝片置于載物臺上，用標本夾夾住，將觀察位置移至物鏡正下方，物鏡降至距離裝片0.5厘米處，適當縮小光圈然后兩眼從目鏡觀察，轉動粗調節(jié)器使物鏡逐漸上升（或使鏡臺下降）至發(fā)現(xiàn)物象時，改用細調節(jié)器調節(jié)到物象清楚為止。移動裝片，把合適的觀察部位移至視野中心。（三）高倍鏡觀察眼睛離開目鏡從側面觀察，旋轉轉換器，將高倍鏡轉至正下方，注意避免鏡頭與玻片相撞。再由目鏡觀察，仔細調節(jié)光圈，使光線的明亮度適宜。用細調節(jié)器校正焦距使物象清晰為止

14、。將最適宜觀察部位移至視野中心，繪圖。不要移動裝片位置，準備用油鏡觀察。（四）油鏡觀察1、提起鏡筒約2厘米，將油鏡轉至正下方。在玻片標本的鏡檢部位（鏡頭的正下方）滴一滴香柏油。2、從側面注視，小心慢慢降下鏡筒，使油鏡浸在油中至油圈不擴散為止，鏡頭幾乎與玻片接觸，但不可壓及裝片，以免壓碎玻片，損壞鏡頭。3、將光圈調亮，左眼從目鏡觀察，用粗調節(jié)器將鏡筒徐徐上升（切忌反放向旋轉），當視野中出現(xiàn)物象時，改用細調節(jié)器調節(jié)到物象清楚為止。如因鏡頭下降未到位或鏡頭上升太快未找到物象，必須再從側面觀察，將油鏡降下，重復操作直至物象看清為止。仔細觀察并繪圖。4、再次觀察 提起鏡筒，換上放線菌染色裝片，依次用低倍

15、鏡、高倍鏡和油鏡觀察，繪圖。重復觀察時可比第一次少加香柏油。（五）鏡檢完畢后的工作1、 提起鏡筒，或降下載物臺2、 移開物鏡鏡頭3、 取出裝片4、 清潔油鏡 油鏡使用完畢后，須用擦鏡紙擦去鏡頭上的香柏油，再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦掉殘留的香柏油，最后再用干凈的擦鏡紙擦干殘留的二甲苯。5、 擦凈顯微鏡，將各部分還原。將物鏡呈“八”字形降下，不可使其正對聚光器，同時降下聚光器，轉動反光鏡使其鏡面垂直于鏡座。最后套上鏡罩，對號放入鏡箱中，置陰涼干燥處存放。四、注意事項1、使用油鏡必須按先用低倍鏡和高倍鏡觀察，再用油鏡觀察的程序操作。2、下降鏡頭時，一定要從側面注視，切忌用眼睛對著目鏡，邊觀察邊下降鏡頭

16、的錯誤操作，以免壓碎玻片而損壞鏡頭。3、使用二甲苯擦鏡頭時，注意二甲苯不能過多，以防溶解固定透鏡的樹脂。4、注意保持顯微鏡的潔凈，對金屬部分要用軟布擦拭，擦鏡頭必須用擦鏡紙，切勿用手或用普通布、紙等，以免損壞鏡頭。五、演示如何使用油鏡觀察染色裝片的要點，如滴油、下降鏡頭、調焦、擦拭鏡頭等六、實驗報告分別繪出在高倍鏡和油鏡下觀察到的枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌的形態(tài)，注明物鏡放大倍數(shù)和總放大率七、問題和思考1、用油鏡便于觀察細菌的依據(jù)是什么？2、使用油鏡應特別注意哪些問題？3、當物鏡從低倍鏡轉換到高倍鏡和油鏡時，對照明度有何要求？應如何調節(jié)？實驗四 細菌形態(tài)的觀察一、實驗目的和實驗內(nèi)容目的：鞏固

17、油鏡的使用；掌握細菌形態(tài)觀察的基本方法，了解細菌的基本形態(tài)內(nèi)容：1、觀察細菌的基本形態(tài)染色裝片2、觀察枯草芽孢桿菌活菌3、觀察細菌細胞結構的染色裝片二、實驗材料和用具大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌；變形菌裝片三、操作步驟（一）、觀察細菌的基本形態(tài)用低倍鏡、高倍鏡和油鏡觀察大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、變形菌的染色裝片，并分別在油鏡下繪圖（二）、觀察枯草桿菌活菌(常用壓滴法)：1、 將潔凈無油膩的載片放于自己正前方，在中央放一滴無菌水2、 將酒精燈放于自己正前方，點燃3、 用無菌操作方法從枯草芽孢桿菌斜面中沾取少量菌體，與載片上的隨地充分混勻，把接種環(huán)上殘留的菌體殺滅后，放回試管架4、

18、 用鑷子夾一潔凈的蓋玻片，使其一邊先接觸菌液，然后將整個蓋玻片慢慢放下，注意不要產(chǎn)生氣泡。如菌液過多，可用吸水紙吸去一部分。5、 先用低倍鏡然后轉用高倍鏡觀察，觀察時光線要適當調暗一些。四、注意事項1、 注意擦鏡頭時，只能用擦鏡紙2、 觀察完畢，必須將鏡筒上升，才能取下裝片，放入另一裝片后，要按使用油鏡要求，重新操作，不能在油鏡下直接取下和替換裝片3、 無菌操作過程中，接種環(huán)美軍后不能觸及其他物品，挑菌不能過多五、演示1、 細菌細胞結構裝片示范鏡2、 無菌操作過程3怎樣蓋蓋玻片才不產(chǎn)生氣泡。 六、實驗報告(一) 繪圖1 繪出你所觀察到的幾種細菌的個體形態(tài)視野圖2 繪出你所觀察到的細菌細胞結構視

19、野圖，并注明各部分(二) 試指出在制備活菌裝片時，應注意什么問題?七、 問題與思考1用明視野顯微鏡觀察細菌的形態(tài)時，你認為用染色裝片好，還是用非染色的活體裝片好，為什么?觀察活體裝片與染色裝片，光線調節(jié)各有什么不同?2無菌操作過程中，可否將棉塞放在桌面上?為什么?實驗五 細菌的革蘭氏染色一、 實驗目的和內(nèi)容 目的：初步掌握細菌涂片方法及革蘭氏染色法步驟內(nèi)容：1制作細菌染色裝片。2進行革蘭氏染色法操作二、 實驗材料和用具金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Ecoli)菌液，待測菌菌液12種。革蘭氏染色液(結晶紫染液、盧戈氏碘液、95乙醇、石炭酸復紅液等)、香柏油

20、、二甲苯、顯微鏡、擦鏡紙、接種環(huán)、酒精燈、載玻片、吸水紙、試管、小滴管三、 操作步驟（一）制片1涂菌 用無菌操作方法從試管中沽取菌液一環(huán)，用接種環(huán)在潔凈無脂的載玻片上做一薄而均勻、直徑約lcm的菌膜。涂菌后將接種環(huán)火焰滅菌2干燥 于空氣中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加溫加速干燥(溫度不宜過高)。3固定 目的是殺死細菌并使細菌粘附在玻片上，便于染料著色，常用加熱法，即將細菌涂片膜向上，通過火焰3次，以熱而不燙為宜，防止菌體燒焦、變形。此制片可用于染色。(二)染色 1初染 于制片上滴加結晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。 2媒染 滴加盧戈氏碘液，1min后水洗。 3脫色 滴加95乙醇

21、脫色，搖動玻片至紫色不再為乙醇脫退為止(根據(jù)涂片之厚度需時30s至lmin)，水洗。 4復染 滴加石炭酸復紅液復染1min，水洗。 5用濾紙吸干，油鏡鏡檢。(三)結果 革蘭氏陽性菌染成藍紫色，革蘭氏陰性菌染成淡紅色。(四)檢測未知菌用以上方法對未知菌進行革蘭氏染色，并繪圖、記錄染色結果。四、注意事項 1涂片務求均勻，切忌過厚。 2在染色過程中，不可使染液干涸。 3脫色時間十分重要，過長，則脫色過度，會使陽性菌被染成陰性菌。4老齡菌因體內(nèi)核酸減少，會使陽性菌被染成陰性菌，故不能選用。五、演示制片方法及染色過程。六、實驗報告 (一)繪圖 1大腸桿菌革蘭氏染色視野圖。 2金黃色葡萄球菌革蘭氏染色視野

22、圖。 (二)記錄革蘭氏染色法法步驟，并進行結果分析。（三）未知菌的檢測結果。七、問題和思考 1涂片后為什么要進行固定?固定時應注意什么? 2什么是革蘭氏染色法?染色過程應注意什么? 3試分析革蘭氏染色法在細菌分類中的意義。 實驗六 放線菌的形態(tài)觀察實驗一、實驗目的和內(nèi)容目的：辨認放線菌的營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲、孢子絲、孢子的形態(tài)；學習放線菌的觀察方法 內(nèi)容：用水封片法、玻璃紙法、印片法觀察放線菌的形態(tài)特征，二、實驗材料和用具 細黃鏈霉菌(Streptornyces micuoflavus)又稱5406的培養(yǎng)平皿，棘孢小單孢菌(Micromonospra echinospora)的玻璃紙培養(yǎng)子皿。0

23、1美藍染色液、石炭酸復紅染色液、蓋玻片、載玻片、鑷子、接種環(huán)、顯微鏡、涂布器、玻璃紙、打孔器三、操作步驟(一) 觀察自然生長狀態(tài)的放線菌用鑷子小心取出用插片法培養(yǎng)的5406菌培養(yǎng)皿中的一張蓋玻片，將其背面附著的菌絲體擦凈。然后將長有菌的一面向上放在潔凈的載玻片上，用低倍鏡、高倍鏡觀察。找出3類菌絲及其分生孢子，并繪圖。注意放線菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細和色澤差異。（二）水封片觀察取一滴美藍染色液置于載玻片中央，將用搭片法培養(yǎng)棘孢小單孢菌培養(yǎng)皿中的蓋玻片取出，并將有菌面朝下，放在載玻片上，浸在染色液中，制成水封片，用高倍鏡觀察其單個分生孢子及其基內(nèi)菌絲，并繪圖（三）玻璃紙法的鏡檢觀察1、直接玻

24、璃紙觀察 分別用5406和棘轉孢小單孢菌的玻璃紙制片觀察。制片時，于載玻片上放一小滴蒸餾水，將含菌玻璃紙片小心剪下一小塊，移至載玻片上，并使有菌面向上。在玻璃紙與載玻片間不能有氣泡，以免影響觀察。將制片于顯微鏡下觀察，先用低倍鏡觀察菌的立體生長狀況，再用高倍鏡仔細觀察。注意區(qū)分5406菌的基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和彎曲狀或螺旋狀的孢子絲觀察棘孢小單孢菌時注意把視野調暗，其基內(nèi)菌絲纖細發(fā)亮，其單個分生孢子發(fā)暗，直接生長在基內(nèi)菌絲長出的小梗上。繪圖2、印片染色法觀察 用鑷子取潔凈載玻片并微微加熱，然后用這微熱載玻片蓋在長有5406或棘孢小單孢菌的平皿上，輕輕壓一下，注意將載玻片垂直放下和取出，以防載玻片

25、水平移動而破壞放線菌的自然形態(tài)。反轉有印痕的載玻片微微加熱固定，用石炭酸復紅染色lmin，水洗，晾干用油鏡觀察。繪圖。注意比較兩種菌的形態(tài)特征有何不同。四、注意事項1、培養(yǎng)放線菌中要注意，放線菌的生長速度較慢，培養(yǎng)期較長，在操作中應特別注意無菌操作，嚴防雜菌污染2玻璃紙法培養(yǎng)接種時注意玻璃紙與平板瓊脂培養(yǎng)基間不宜有氣泡，以免影響其表面放線菌的生長3不同觀察方法中嚴格按要求進行，注意菌體的上下位置五、演示1. 幾種不同的培養(yǎng)方法。2. 幾種觀察方法的要點和注意事項3. 5406菌及棘孢小單孢菌形態(tài)的示范鏡。六、實驗報告1、繪圖 玻璃紙法、水封片法、印片法及自然生長狀態(tài)下觀察的放線菌形態(tài)2、試比較

26、5406菌與棘孢小單孢菌特征的異同七、問題和思考1、在高倍鏡或油鏡下如何區(qū)分放線菌的基內(nèi)菌絲和氣生菌絲?2、用插片法和搭片法如何制備放線菌標本，其主要優(yōu)點是什么?可否用此法觀察其他微生物？為什么？注： (一)插片法和搭片法培養(yǎng)放線菌 1插片法 (1)制平板、接種：用冷卻至約50的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基倒平板(每皿約20mL)，可用兩種方法A先接種后插片：冷凝后用接種環(huán)挑取少量斜面上的5406菌孢子，用平板培養(yǎng)基的一半面積作來回劃線接種（接種量可適當加大）。B先插片后接種：用平板培養(yǎng)基的另一半面積進行。 (2)插片及培養(yǎng)：用無菌鑷子取無菌蓋玻片，在已接種平板上以45角斜插入培養(yǎng)基內(nèi)，插入深度約占蓋玻

27、片12長度。同時，在另一半未經(jīng)接種的部位以同樣方式插入數(shù)塊蓋玻片，然后接種少量5460菌孢子至蓋玻片一側的基部，且僅接種于其中央位置約占蓋玻片長度的一半左右，以免菌絲蔓延至蓋玻片的另一側。將插片平板倒置于28，培養(yǎng)37d2搭片法(1)開槽及接種：用無菌打孔器在凝固后的平板培養(yǎng)基上打洞數(shù)個，并將棘孢小單孢菌孢子劃線接種到洞內(nèi)邊緣。(2)搭片及培養(yǎng)：在接種后的洞面上放一無菌蓋玻片。平板倒置于28，培養(yǎng)37d。(二)玻璃紙法固體培養(yǎng)5406菌和棘孢小單孢菌 1玻璃紙滅菌 將玻璃紙剪成比培養(yǎng)皿直徑略小的片狀，將濾紙剪成培養(yǎng)皿大小的圓形紙片并稍潤濕，然后把濕濾紙和玻璃紙交互重疊地放在培養(yǎng)皿中，借濾紙將玻

28、璃紙隔開。然后進行濕熱滅菌，備用。 2制平板及鋪玻璃紙 取冷凝后的高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，用無菌鑷子將預先滅菌的塊狀玻璃紙平鋪至平板培養(yǎng)基表面，鋪玻璃紙時可用無菌涂布器將玻璃紙與培養(yǎng)基間的氣泡除去。3涂布菌液及培養(yǎng) 取01mL的孢子懸液涂布在鋪有玻璃紙的平板培養(yǎng)基表面。接種平板倒置于28，培養(yǎng)57d。實驗七 酵母菌的形態(tài)觀察實驗一、 實驗目的和內(nèi)容：目的：了解自然存在的酵母菌及其形態(tài)結構。了解酵母菌產(chǎn)生子囊孢子的條件及其形態(tài)內(nèi)容：1觀察酵母菌個體形態(tài)。 2觀察酵母菌的假菌絲和繁殖過程。3觀察自然狀態(tài)的酵母菌。二、實驗材料和用具 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、熱帶假絲

29、酵母(Candida tropicalis)斜面菌種。 PDA培養(yǎng)基、麥氏(McCLary)培養(yǎng)基(醋酸鈉培養(yǎng)基)、005美藍染色液(以pH 60的002molL磷酸緩沖液配制)、碘液、004的中性紅染色液、5孔雀綠，05沙黃液、95乙醇。顯微鏡、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、V形玻璃棒、放置一個三角形玻璃棒支架的培養(yǎng)皿。三、操作步驟 (一)酵母菌形態(tài)觀察1酵母菌的活體染色觀察及死亡率的測定(1)以無菌水洗下PDA斜面培養(yǎng)的釀酒酵母菌苔，制成菌懸液。(2)取005美藍染色液1滴，置載玻片中央，并用接種環(huán)取酵母菌懸液與染色液混勻，染色23min，加蓋玻片，在高倍鏡下觀察酵母菌個體形態(tài)，區(qū)分其母

30、細胞與芽體，區(qū)分死細胞(藍色)與活細胞(不著色)。(3)在一個視野里計數(shù)死細胞和活細胞，共計數(shù)56個視野。 酵母菌死亡率一般用百分數(shù)來表示，以下式來計算： 死亡率=死細胞總數(shù)/死活細胞總數(shù)（%）2酵母菌液泡系的活體觀察 于潔凈載玻片中央加一滴中性紅染色液，取少許上述酵母菌懸液與之混合，染色5min，加蓋玻片在顯微鏡下觀察。細胞無色，液泡呈紅色。3酵母菌細胞中肝糖粒的觀察 將1滴碘液置于載玻片中央，接入上述酵母菌懸液，混勻，蓋上蓋玻片，顯微鏡觀察，細胞內(nèi)的貯藏物質肝糖顆粒呈深紅色。4酵母菌子囊孢子的觀察 (1)活化釀酒酵母：將釀酒酵母接種至新鮮的PDA培養(yǎng)基上，置28C培養(yǎng)23d，然后再移植23

31、次。 (2)移接產(chǎn)孢培養(yǎng)基：將活化的釀灑酵母移接至醋酸鈉培養(yǎng)基上，置30C恒溫培養(yǎng)14d。 (3)觀察：挑取少許產(chǎn)孢菌苔于載玻片的水滴上，經(jīng)涂片、熱固定后，加數(shù)滴孔雀綠，lmin后水洗，加95乙醇30s，水洗，最后用o5沙黃液復染30s，水洗去染色液，最后用吸水紙吸干。制片干燥后，鏡檢，子囊孢子呈綠色，子囊為粉紅色。注意觀察子囊孢子的數(shù)目、形狀和子囊的形成率。 (4)計算子囊形成的百分率：計數(shù)時隨機取3個視野，分別計數(shù)產(chǎn)子囊孢子的子囊數(shù)和不產(chǎn)孢子的細胞，然后按下列公式計算： 子囊形成率() 三個視野中形成子囊的總數(shù)/三個視野中（形成子囊的總數(shù)加不產(chǎn)豹子細胞總數(shù)） XlOO5酵母菌假菌絲的觀察

32、取一無菌載玻片浸于溶化的PDA培養(yǎng)基中，取出放在濕室培養(yǎng)的支架上，待培養(yǎng)基凝固后，進行酵母菌劃線接種，然后將無菌蓋玻片蓋在接菌線上，28培養(yǎng)23d后，取出載玻片，擦去載玻片下面的培養(yǎng)基，在顯微鏡下直接觀察。可見到芽殖酵母形成的藕節(jié)狀假菌絲，裂殖酵母則形成竹節(jié)狀假菌絲。6自然狀態(tài)下的酵母菌觀察 取一滴美藍染色液于載玻片中央，春夏秋季取醬油或淹菜上的白膜，冬季取腌酸菜湯上的白膜，將其置于載玻片染色液中，蓋上蓋玻片，顯微鏡下仔細觀察酵母菌形態(tài)，出芽生殖，假菌絲等。 四、注意事項1、用于活化酵母菌的麥芽汁培養(yǎng)基要新鮮、表面濕潤。2、在產(chǎn)孢培養(yǎng)基上加大移種量，可提高子囊形成率。3、通過微加熱增加酵母的死

33、亡率，易于觀察死亡細胞。五、演示1酵母菌子囊及子囊孢子，酵母菌假菌絲的示范鏡。2假菌絲培養(yǎng)的操作過程。六、實驗報告(一)繪圖1數(shù)個酵母菌細胞，示觀察到的結構。2數(shù)個子囊及子囊孢子形態(tài)圖。(二)記錄并計數(shù)酵母菌的死亡率及子囊形成率(原始記錄及計算結果)。七、問題和思考 1酵母菌的假菌絲是怎樣形成的?與霉菌的真菌絲有何區(qū)別?2如何區(qū)別營養(yǎng)細胞和釋放出的子囊孢子?3試設計一個從子囊中分離子囊孢子的試驗方案。注： 酵母菌的簡易培養(yǎng) 配2葡萄糖水(或白糖水)，煮沸，裝入三角瓶中(液面高度23cm)，加HCl調至pH34，放人幾塊葡萄皮(或其他糖分較高的果皮)，置2528溫箱中培養(yǎng)2-3d，聞到酒香味后，

34、即可取培養(yǎng)液鏡檢。實驗八 霉菌的形態(tài)觀察一、實驗目的和內(nèi)容目的：了解霉菌形態(tài)，掌握微生物載玻片濕室培養(yǎng)方法。內(nèi)容：1霉菌載玻片濕室培養(yǎng)。 2曲霉、青霉、根霉、毛霉形態(tài)觀察。3根霉假根的觀察。二、實驗材料和用具 產(chǎn)黃青霉、黑曲霉、黑根霉、總狀毛霉等斜面菌種。 半固體PDA培養(yǎng)基、乳酸苯酚固定液、棉藍染色液、20甘油。 透明膠帶、剪刀、培養(yǎng)皿、門形玻棒擱架、蓋玻片、圓形濾紙片、細口滴管、鑷子、顯微鏡、接種環(huán)、載玻片、擦鏡紙、蓋玻片、接種環(huán)、吸水紙等三、操作步驟(一)霉菌的載玻片濕室培養(yǎng)可4人合作，每人制作一霉菌的載玻片。1準備濕室 在培養(yǎng)皿底鋪一張圓形濾紙片，其上放一“門”形載玻片擱架，在擱架上放

35、一塊載玻片和兩塊蓋玻片，蓋上皿蓋，外用紙包扎，經(jīng)121濕熱滅菌30min后，置60烘箱中烘干，備用。2取菌接種 用接種環(huán)挑取少量待觀察的霉菌孢子至濕室內(nèi)的載玻片上，每張載玻片可接同一菌種的孢子兩處。接種時只要將帶菌的接種環(huán)在載玻片上輕輕碰幾下即可(務必記住接種的位置)。3加培養(yǎng)基 用無菌細口滴管吸取少量融化約60的培養(yǎng)基，滴加到載玻片的接種處，培養(yǎng)基應滴得圓而薄，其直徑約為05cm(滴加量一般以1Q小滴為宜)。4。加蓋玻片 在培養(yǎng)基未徹底凝固前，用無菌鑷子將皿內(nèi)蓋玻片蓋在瓊脂塊薄層上、用鑷子輕壓，使蓋玻片和載玻片間的距離相當接近，但不能壓扁，否則不透氣。5倒保濕劑 每皿倒人約3mL20的無菌甘

36、油，使皿內(nèi)的濾紙完全潤濕，以保持皿內(nèi)濕度。皿蓋上注明菌名、組別和接種日期。此為制成的載玻片濕室，置28C恒溫培養(yǎng)35de(二)黑根霉假根的培養(yǎng) 將融化的PDA培養(yǎng)基，冷卻至50C倒入無菌平皿，其量約為平皿高度的1超。冷凝后，用接種環(huán)沾取根霉孢子，在乎板表面劃線接種。然后將平皿倒置，在皿蓋內(nèi)放一無菌載玻片，于28培養(yǎng)23d后，可見根霉的氣生菌絲倒掛成胡須狀，有許多菌絲與載玻片接觸，并在載玻片上分化出假根和匍匐菌絲等結構。(三)鏡檢觀察 1濕室培養(yǎng)霉菌鏡檢載玻片 從培養(yǎng)1620h開始，通過連續(xù)觀察，可了解孢子的萌發(fā)、菌絲體的生長分化和子實體的形成過程。將濕室內(nèi)的載玻片取出，直接置于低倍鏡和高倍鏡下

37、觀察曲霉、青霉、毛霉、根霉等霉菌的形態(tài)，重點觀察菌絲是否分隔，曲霉和青霉的分生孢子形成特點，曲霉的足細胞，根霉和毛霉的孢子囊和孢囊孢子。繪圖。 2粘片觀察 取一滴棉藍染色液置于載玻片中央，取一段透明膠帶，打開霉菌平板培養(yǎng)物，粘取菌體，粘面朝下，放在染液上。鏡檢。 3假根觀察 將培養(yǎng)根霉假根的平皿打開，取出皿蓋內(nèi)的載玻片標本，在附著菌絲體的一面蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察。只要用低倍鏡就能觀察到假根及從根節(jié)上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和兩個假根間的匍匐菌絲，觀察時注意調節(jié)焦距以看清各種構造。 4制成永久裝片 把觀察到霉菌形態(tài)較清晰，完整的片子，制成標本作較長期保存。制備方法是，輕輕揭去蓋玻

38、片，如果載玻片上有瓊脂，仔細挑去，然后滴加少量乳酸苯酚固定液，蓋上清潔蓋玻片，在蓋玻片四周滴加樹膠封固。 四、注意事項 載玻片濕室培養(yǎng)時，蓋玻片不能緊貼載玻片，要彼此有極小縫隙，一是為了通氣；二是使各部分 結構平行排列，易于觀察。五、演示 14種霉菌制片的示范。 2載玻片濕室培養(yǎng)方法。六、實驗報告(一)繪制鏡檢形態(tài)圖 1、 毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部2、 青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部（二）載玻片觀察紀錄各菌種的載玻片標本觀察結果菌種菌絲體（氣生菌絲、營養(yǎng)菌絲的粗細、色澤，菌絲有隔或無隔等）無性菌絲特征（孢子梗的分化特征，孢子著生特征等）其他特征結構（有無假根、足細胞、匍匐菌絲、囊軸等七、問題和思考1

39、、 什么叫載玻片濕室培養(yǎng)？它適用于觀察什么樣的微生物，有何優(yōu)點？2、 濕室培養(yǎng)時為何用20%甘油作保濕劑？3、 本實驗中觀察假根的設計原理是什么？此設計還適用于培養(yǎng)那些菌？實驗九 細菌數(shù)量的測定(設計性實驗)-計數(shù)市售酸奶或口服液或菌肥制品的單位含菌數(shù)一、實驗目的和內(nèi)容 目的：掌握細菌數(shù)量的測定方法。 內(nèi)容：1計數(shù)板直接鏡檢計數(shù)。 2載玻片直接鏡檢計數(shù)。 3平板菌落計數(shù)。二、實驗方案自行設計三、實驗材料 市場采集四、用具顯微鏡、血細胞計數(shù)板、手動計數(shù)器、酒精燈、無菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡紙、無菌試管、涂布器、無菌培養(yǎng)皿等。五、實驗報告 (一)記錄實驗結果(二

40、)比較以上3種不同計數(shù)方法所得的結果并進行分析。附:細菌數(shù)量的測定(實驗參考)一、實驗目的和內(nèi)容 目的：掌握細菌數(shù)量的測定方法。 內(nèi)容：1計數(shù)板直接鏡檢計數(shù)。 2載玻片直接鏡檢計數(shù)。 3平板菌落計數(shù)。二、實驗材料和用具 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)斜面培養(yǎng)物(約培養(yǎng)l0h)、培養(yǎng)57d的大腸桿菌(Ecoli)菌液。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、美藍染色液、結晶紫染色液、香柏油、二甲苯、無菌水。 顯微鏡、血細胞計數(shù)板、手動計數(shù)器、酒精燈、無菌吸管、濾紙條、載玻片、蓋玻片、無菌微量移液管、接種環(huán)、擦鏡低、無菌試管、涂布器、無菌培養(yǎng)皿。三、操作步驟(一)計數(shù)板直接鏡檢計數(shù) 1血細胞計數(shù)

41、板的構造血細胞計數(shù)板由四條平行槽構成3個平臺，中間的平臺較寬，其中間又被一短槽隔成兩半，每邊平臺面各有一個含9個大格的方格網(wǎng)，中間大格為計數(shù)室。計數(shù)室的長和寬各為lmm，中間平臺下陷01mm，故蓋上蓋玻片后計數(shù)室的容積為01mm3。血細胞計數(shù)板的構造見圖16。常見血細胞計數(shù)板的計數(shù)室有兩種規(guī)格。一種是16X 25型，稱為麥氏血細胞計數(shù)板，共有16個中格，每個中格分為25個小格。另一種是25X16型，稱為希里格式血細胞計數(shù)板，共有25個中格，每個中格又分成16個小格。但是不管哪種規(guī)格的血細胞計板其計數(shù)室的小格均由400個小方格組成。應用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下直接計算微生物細胞的數(shù)量，方法是先測定

42、若干個方格中的微生物細胞，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細胞數(shù)量。 2細菌數(shù)量的測定 (1)稀釋加樣；取枯草芽孢桿菌斜面少量菌體至100mL無菌水中，稀釋混勻后待用(濃度約為104105mL)。先將蓋玻片放在計數(shù)室上，用吸管吸取以上稀釋液滴于蓋玻片的邊緣，讓菌液自行滲入，多余菌液用濾紙吸去，稍待片刻，待細菌細胞全部沉降到計數(shù)室底部，將計數(shù)板放于載物臺的中央，按下列步驟尋找計數(shù)室并計數(shù)。 (2)找計數(shù)室：先在低倍鏡下尋找計數(shù)板大方格網(wǎng)的位置，轉換高倍鏡后，調節(jié)光亮度至菌體和計數(shù)室線條清晰為止，再將計數(shù)室一角的小格移至視野中。順著大方格線移動計數(shù)板，使計數(shù)室位于視野中間。 (3)計數(shù)：計

43、數(shù)時，如用16X25型計數(shù)板則按對角線方位，取左上、右上、左下、右下4個大格(共4個大格，100個小格)內(nèi)的細胞逐一進行計數(shù)；如使用規(guī)格為25X16型的計數(shù)板，則除取左上、右上、左下、右下4個大格外，還需加中央的一個大格(共5個大格，80個小格)內(nèi)的細胞。計數(shù)時當遇到大格線上的細菌時，一般只計此大格的上方及右方線上的細胞(或只計下方及左方線上的細胞)，將計得的細胞數(shù)填入結果表中，對每個樣品重復計數(shù)3次，取其平均值，按下列公式計算每mL菌液中所含的細菌細胞數(shù)。16X25和25X16型血細胞計數(shù)板的計算公式(二)載玻片直接鏡檢計數(shù) 1搖動菌液使其混合均勻，用無菌微量移液管取菌液001mL于載玻片上，并用無菌接種環(huán)均勻地涂布在1cm2的面積上。風干，固定，結晶紫染色1min，沖洗，干燥備用。 2用物鏡測微尺，測量顯微鏡油鏡觀察時的視野直徑，并以S=r2公式，計算出視野面積。 3將涂片置于載物臺，滴香柏油，以油鏡觀察，不斷變化視野，共觀察10個視野，計數(shù)每一視野中細菌個數(shù)。以下列公式計算每毫升菌液中的含菌數(shù)量。(三)平板菌落計數(shù) 另取滅菌移液管