第五講 分子克隆載體

1、,分子克隆載體,基因操作的基本步驟,載 體,單獨一個包括啟動子、編碼區(qū)和終止子的基因，或者組成基因的某個元件，一般是不易進入受體細胞的，即使采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內維持。 載體(vector): 能攜帶外源基因（或DNA片段）進入細胞復制、整合或表達的工具。,作為克隆載體的DNA分子具備的條件： 1 具有對受體細胞的可轉移性，能攜帶外源基因進入宿主細胞； 2 能在宿主細胞中自主復制，并實現(xiàn)外源基因的增殖；,3 具有由單一限制酶識別位點組成的多克隆位點(MCS）； 4 克隆載體必須具有用于選擇克隆子的標記基因； 5 克隆載體必須是安全的，不應含有對受體細胞有害的基因，并且不會

2、任意轉入除受體細胞以外的其他生物的細胞，尤其是人的細胞。,多克隆位點,ori,復制起始點,遺傳標記,Ampr,MCS,克隆載體,按功能分： 克隆載體 表達載體,質粒克隆載體 (plasmid cloning vector),質粒(plasmid):是一種寓于宿主細胞中染色體外裸露的dsDNA分子。 一個質粒就是一個DNA分子。 Plasmid chromosome,存在于細菌、真菌、藍藻和綠藻的細胞中，在細菌細胞中最多。,質粒的存在形式： 一般以超螺旋共價閉環(huán)DNA分子(ccc-DNA)的形式存在。 也可以開環(huán)DNA分子(oc-DNA)和線性DNA分子(L-DNA)的形式存在。,質粒DNA的大

3、小 質粒 宿主 大?。╧b） pPbs 藍藻 1.5 CoLE1 大腸桿菌 6.4 PV21 三葉草根瘤菌 700 多數(shù)在10kb左右,質粒的基本性質： 1 復制,按照質粒控制拷貝數(shù)的程度，可以將質粒分為: 1）嚴謹型質粒(stringent plasmid) 拷貝數(shù)少，為15個 2 ）松散型質粒(relaxed plasmid) 拷貝數(shù)多，可達10個拷貝以上,某種質粒屬于嚴謹型或是松散型的，與宿主有一定的關系。 例子：質粒ColE1-K30在大腸桿菌中屬于松散型的，在奇異變形桿菌中是嚴謹型的。 一般來說，希望構建的質?？寺≥d體是松散型的，所以在構建的克隆載體中應含有松散型的復制起始位點和調控

4、復制拷貝數(shù)的基因。,2 質粒的不相容性(incompatibility): 兩種質粒在同一宿主細胞中不能共存的現(xiàn)象。 親緣關系密切的不同質粒一般屬于不親和性質粒。 野生型質粒與其衍生的重組質粒屬于不親和性質粒。 當質粒載體承載目的基因轉化受體細胞時，考慮受體細胞內原有的質粒與作為克隆載體的質粒是否屬于親和性質粒。 作為受體細胞最好不含內源質粒。,3 質粒的轉移性,接合型質粒 (conjugative plasmid)： 轉移基因tra：指令宿主細胞產(chǎn)生菌毛、合成細胞表面物質，促使宿主細胞與受體細胞的結合，使質粒從一個細胞轉移到另一個細胞。 非接合型質粒(non-conjugative plas

5、mid)： 順式作用元件： bom位點 移動基因：mob基因 (分子質量小、拷貝數(shù)多、被動遷移),構建質粒載體的基本原則,1 選擇合適的出發(fā)質粒 必備元件： A 復制起始點 B 選擇標記基因 C 克隆位點 D 啟動子 E 終止子 等等.,構建質粒載體的基本原則,2 正確獲得構建質粒載體克隆元件 一般用限制酶切割出發(fā)質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段。 為了獲得含某種元件的DNA片段，選用的切割位點既要保證元件完整無缺，又要使DNA片段愈小愈好，盡可能不含或少含不必要的序列，使構建的載體盡可能小。,構建質粒載體的基本原則,組裝合適的選擇標記基因 構建供轉化大腸桿菌用的質粒載體，可組裝藍

6、/白顏色進行選擇的(B-半乳糖苷酶基因)lacz基因。 但構建供轉化藍藻用的質粒載體不能用這個基因。因為藍藻含有大量的藻藍蛋白。,構建質粒載體的基本原則,4 選用合適的啟動子 如果用真核生物基因的啟動子作為原核生物表達克隆載體的啟動子，其功效下降； 原核生物和病毒基因的啟動子用作真核生物表達克隆載體的啟動子，可保留其原來的功效。,構建質粒載體的基本原則,5 在能達到預期目的的情況下，構建過程要力求簡單。,構建質?？寺≥d體的基本策略,1.構建的質?？寺≥d體應該是能在轉化的受體細胞中進行有效的復制，并作為質?？寺≥d體，希望在受體細胞中有較多的拷貝數(shù)。 2.構建的質?？寺≥d體必須含有允許外源DNA片

7、段克隆的位點，并這樣的克隆位點應盡可能多。,3.構建的質?？寺≥d體必須含有供選擇克隆子的標記基因。 4.構建的質?？寺≥d體DNA分子應盡可能小。 5.根據(jù)特殊需要，使構建的質粒克隆載體中組裝各種元件，構建成不同用途的質?？寺≥d體。,質粒的命名,用小寫字母p代表質粒（plasmid），在p字母后用兩個或三個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)這一質粒的作者或實驗室名稱，再加上質粒編號。 如：pBR322：p表示一種質粒，而“BR”則是分別取自該質粒的兩位主要構建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322為編號。,選擇標記基因：(用于鑒別目的DNA的存在，將成功轉化了載體的宿主挑選出來） (1)氨

8、芐青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr) (3)四環(huán)素抗性基因 （tcr tetr） (4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr) (5)新霉素抗性基因（neor）,pBR322的大小是4361bp的環(huán)狀雙鏈DNA，其堿基序列已經(jīng)全部清楚。是最早應用于基因工程的載體之一。 含有24種限制酶的單一識別位點，具有四環(huán)素抗性基因(tetr)和氨芐青霉素抗性基因(ampr)。 將質粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和質粒pSC101中含tetr基因的DNA片段同含ColE1復制起始點(來源于pMB1、松散型)的DNA片段重組，構建成質?？寺≥d體pBR3

9、22。,pBR322,普通型載體pBR322的結構圖,pBR322,如何篩選？ 利用Tetr基因內部的BamHI位點來插入外源DNA片段，可以通過插入失活進行篩選。 BamHI G/GATTC,經(jīng)重組DNA分子轉化處理的受體菌在不含標記藥物tc的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則含或不含重組DNA分子的受體菌都能長出菌落。 然后取菌落的一部分接種在含tc 的瓊脂培養(yǎng)基上，不會長出菌落的原菌落才是真正在tcr基因區(qū)插入外源DNA片段的克隆子。 （為什么？）,pUC質粒,pUC質粒系列是在pBR322基礎上改建成的； 包括pBR322的ampr基因； 缺乏控制拷貝數(shù)的rop基因。,pUC的主要優(yōu)點： （1）分子

10、量更小，僅為2686bp，容納外源DNA量增大；具有更高的拷貝數(shù)（每個細胞含500-700個拷貝）。 （2）含易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因LacZ，可利用-互補原理進行藍白篩選。 （3）多克隆位點區(qū)（MCS）由人工合成的多個單一酶切位點構成。,pUC18,pUC19,含四個部分： （1）來自pBR322的質粒復制起點（ori）； （2）ampr ; （3）大腸桿菌半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列； （4）多克隆位點（MCS）,lacZ,Ori,Ampr,MCS,Blue White,ampr,ampr,Insert,Insert,No insert,Lac

11、 Z,Lac Z,噬菌體載體 （lambda phage vector）,把感染細菌的病毒稱為噬菌體。 病毒主要有DNA（或RNA）和外殼蛋白組成。通過感染，病毒顆粒進入宿主細胞。,T2噬菌體結構示意圖,噬菌體的性質,1 噬菌體由DNA和外殼蛋白組成。 2 在噬菌體中DNA是線性的，全長48502bp，左右各有12個核苷酸組成的5凸出黏性末端，而且是互補的。 5GGGCGGCGACCTNN.NN3 3NN.CCCGCCGCTGGA5 把此末端稱為 COS位點(cohesive end site) 3 其有50個以上基因 4 有56種限制酶識別位點 5 生長途徑有溶源途徑和溶菌途徑。,溶菌途徑：

12、噬菌體感染宿主細胞后，其DNA不插入染色體DNA，經(jīng)過一段時間的潛伏期，就大量增殖新的病毒顆粒，使宿主細胞破裂，釋放的病毒顆粒又感染其他細胞。（左圖示）,溶源途徑：感染宿主細胞后，其DNA與宿主細胞染色體DNA整合，一起復制和傳代，無感染其他細胞的能力。（右圖示）,噬菌體的基因組分區(qū),左區(qū)：Nul基因J基因之間的基因 其產(chǎn)物用于噬菌體DNA的包裝和噬菌體顆粒的形成。,噬菌體的基因組分區(qū),中區(qū)：J基因右邊gam基因之間的基因 溶源狀態(tài)的發(fā)生和維持以及遺傳重組所需要的基因。（外源DNA片段的插入）,噬菌體的基因組分區(qū),右區(qū)：gam基因右邊Rz基因之間的基因 主要用于噬菌體的復制和裂解宿主菌。,用噬

13、菌體作為克隆載體的依據(jù),1 它是一種溫和噬菌體。 2 能承載比較大的外源DNA片段。 野生型的頭部能包裝DNA分子大小75%105%的DNA片段，約36.451kb。 3 在DNA分子上有許多限制性酶識別位點。,DNA的限制性核酸內切酶譜（Kb）,噬菌體載體的構建過程,1 去除非必須區(qū)，建立外源DNA片段的克隆或替換位點； 2 在DNA的非必須區(qū)內插入選擇標記基因 cI基因：它的表達使噬菌體進入溶原狀態(tài)，基因產(chǎn)物活性受到影響會促進噬菌體進入裂解循環(huán)。 如果外源DNA片段插入基因cI中，將高效地使hfl突變的E.coli進入裂解生長狀態(tài)。,3 建立重組 DNA分子的體外包裝系統(tǒng) 在實驗室重組的

14、DNA分子，必須經(jīng)過體外包裝成噬菌體顆粒后才有效地感染受體細胞。 噬菌體突變株D-和E- 當兩個突變株分別感染受體細胞時，兩者都可復制 DNA，但不能把復制合成的 DNA包裝成噬菌體顆粒。二者蛋白混合，能有效地包裝。,噬菌體的主要類型,1 插入型載體(insertion vector): 通過特定酶切位點允許外源DNA片段插入的載體。外源DNA片段大小0 6 kb。 2 置換型載體(replacement vector): 允許外源DNA片段替換非必須DNA片段的載體。外源DNA片段大小923kb。,插入型載體,主要用于cDNA克隆，允許插入的外源DNA片段大小為06kb。基因cI內的E.co

15、RI 位點作為唯一位點，可以用于外源DNA的插入。,主要用于cDNA文庫、基因組文庫和表達融合蛋白。允許插入的外源DNA片段的大小為07.2kb?；騦ac5編碼區(qū)終止密碼子之前有一個E.coRI，可以用于外源DNA的插入。,置換型載體,在填充片段兩端有對稱分布的MCS，這兩個載體的差別是MCS位點的排列位置相反。,M13噬菌體載體,基因工程中常對單鏈DNA測序、制備探針或實施定點突變，應用此載體就可以獲得單鏈DNA。,黏粒載體(cosmid vector),基本特征： 1 是質粒的衍生物，是帶有cos位點的質粒。 2 其組成有質粒的復制起點(ColE1)、抗性基因、cos位點、MCS。 3

16、大小為57kb 4 能克隆的外源DNA片段最大達40kb。,黏粒載體的特點： （1）具有噬菌體的特性（但因不含噬菌體的全部必需基因，因此不能通過溶菌周期，無法形成子代噬菌體顆粒）； （2）具有質粒的特性（有質粒復制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身僅5-7kb, 克隆極限可達40kb左右）； （4）具有與同源序列質粒進行重組的能力。 廣泛應用于基因組DNA文庫的構建。,部分柯斯質粒的基本特性,人工染色體載體 (artificial chromosome vector),人工染色體載體： 利用染色體的復制功能來驅動外源DNA片段復制的載體。 1 酵母人工染色體載體(YAC) 2

17、 細菌人工染色體載體(BAC),利用釀酒酵母染色體的復制元件構建的載體。 復制的必須元件： 1自主復制序列(autonomously replication sequences,ARS) 是一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進行雙向復制所必須的信號。 2 著絲粒（centromere ,CEN） 有絲分裂過程中紡錘絲的結合位點，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細胞中。 3 端粒重復序列（telomeric repeat , TEL） 用于保護線狀DNA不被細胞內的核酸酶降降，以形成穩(wěn)定的結構。,酵母人工染色體載體(YAC),YAC 載體的選擇標記： 營養(yǎng)缺陷型基因 如色氨酸、亮氨酸合成缺陷型基因trp 1、 leu 2 和his3 尿嘧啶合成缺陷基因ura3 赭石突變抑制基因sup4,赭石突變抑制基因sup4,外源DNA片段的裝載導致抑制基因sup4插入失活，從而使重組菌形成紅色菌落。而載體自身連接轉入到酵母細胞后形成的菌落為白色。,YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般為250400kb，有的可以達到1Mb以上，甚至達到2Mb。 主要用來構建大片段DNA文庫