植物原生質(zhì)體融合技術(shù)

1、第十六章植物原生質(zhì)體融合什么基本原理為什么技術(shù)應(yīng)用如何技術(shù)，微絲、葉綠體、線(xiàn)粒體、質(zhì)膜、囊泡、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管、細(xì)胞壁、高爾基體、植物細(xì)胞模式。細(xì)胞壁由三種主要成分組成：纖維素25-50%、半纖維素53%和果膠5%。什么基本原理，去除植物細(xì)胞壁獲得大量原生質(zhì)體誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合形成雜種細(xì)胞篩選、培養(yǎng)、促進(jìn)雜種細(xì)胞分裂和分化從細(xì)胞團(tuán)、愈傷組織到最終植株形成。為什么要應(yīng)用技術(shù)，植物原生質(zhì)體融合的意義：克服種屬以上植物有性雜交的不相容性障礙為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)造條件。技術(shù)方法如何，第十六章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的制備，植物原生質(zhì)體融合，1。植物原生質(zhì)體的制備，原生質(zhì)

2、體的概念和培養(yǎng)的意義。從原生質(zhì)體材料中分離純化原生質(zhì)體。1.原生質(zhì)體的概念和文化的意義。概念：從植物細(xì)胞壁上去除裸細(xì)胞，稱(chēng)為原生質(zhì)體意義：(1)植物原生質(zhì)體具有再生完整植物的能力。(2)為細(xì)胞融合的研究提供了可能。生產(chǎn)新的雜交品種是可能的。(3)細(xì)胞壁被去除，這降低了細(xì)胞的脫氧核糖核酸酶活性，從而促進(jìn)了外源脫氧核糖核酸的進(jìn)入。為新性狀植株的再生提供了有利條件。(4)是開(kāi)展遺傳學(xué)理論研究的材料。植物原生質(zhì)體在理論研究和細(xì)胞工程中的地位，信息傳遞和能量轉(zhuǎn)換的細(xì)胞壁合成機(jī)制，膜結(jié)構(gòu)和功能的機(jī)制，細(xì)胞間雜交或自交不親和的機(jī)制，植物激素的機(jī)制，體細(xì)胞雜種的融合，各種細(xì)胞器的分離，各種細(xì)胞器的引入和外源基

3、因的引入以誘導(dǎo)突變體。原生質(zhì)體材料的來(lái)源，植物葉片-容易獲得的材料-更容易通過(guò)酶水解分離植物根尖組織-植物花粉可以從各種植物的種子發(fā)芽后獲得-單倍體原生質(zhì)體愈傷組織可以產(chǎn)生，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)-細(xì)胞壁容易解離。3。原生質(zhì)體分離。原生質(zhì)體分離法，機(jī)械分離法在高滲溶液中預(yù)處理細(xì)胞，直到細(xì)胞有輕微的質(zhì)壁。優(yōu)點(diǎn)：該方法可以避免酶制劑對(duì)原生質(zhì)體的破壞。缺點(diǎn)：獲得的完整原生質(zhì)體數(shù)量相對(duì)較少。酶分離中常用的細(xì)胞壁降解酶包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、果酸酶等。它可以獲得大量的原生質(zhì)體，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴佟⒔M織或細(xì)胞都可以通過(guò)酶水解獲得原生質(zhì)體。缺點(diǎn)：酶制劑含有核酸酶、蛋白酶、過(guò)氧化物酶和酚類(lèi)。影響獲

4、得的原生質(zhì)體的活力。影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素：1)不同植物或不同組織和細(xì)胞的細(xì)胞壁組成和結(jié)構(gòu)不同2)滲透壓穩(wěn)定劑：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、鹽(KCl、硫酸鎂、水)等。3)質(zhì)膜穩(wěn)定劑：如硫酸葡聚糖鉀、氯化鈣、磷酸二氫鉀等。增加質(zhì)膜的穩(wěn)定性。4)酶溶液的酸堿度：一般為5.4-6.0 5)溫度因素。6)植物材料的生理狀態(tài)：如植物年齡、發(fā)育狀態(tài)、栽培條件等。對(duì)材料選擇有很大影響。煙草懸浮細(xì)胞：2%海藻糖酶纖維素酶2%纖維素酶纖維素酶0.5%果膠酶；海水。胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：2%紅小豆纖維素酶0.5%干燥酶0.5%半纖維素酶1%果膠酶；0.35毫升甘露醇0.35毫升山梨醇白菜根細(xì)胞等。4%纖維

5、素酶2%半纖維素酶0.3%果膠酶；0.7M甘露醇。番茄無(wú)菌苗的子葉和葉肉細(xì)胞：1.5%纖維素酶0.3%果膠酶；102.6克/升蔗糖。水稻種子愈傷組織懸浮培養(yǎng)細(xì)胞：2%紅小豆纖維素酶1%干燥酶纖維素酶2%馬其頓酶R-10果膠酶1%果膠酶；0.3M葡萄糖，4、原生質(zhì)體純化，除去雜質(zhì)如破碎的原生質(zhì)體、無(wú)壁細(xì)胞、細(xì)胞器和其它碎片，a、過(guò)濾方法b、漂浮方法c、離心方法，實(shí)施例：煙草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體分離，1)。材料準(zhǔn)備和消毒：2)。酶解：3)。凈化：4)選擇在溫室中生長(zhǎng)了大約兩個(gè)月的煙草植物，從健康植物中采摘完全發(fā)育的幼葉，用自來(lái)水沖洗，放入70%乙醇中進(jìn)行表面消毒，然后放入2%次氯酸鈉溶液中處理10分鐘

6、，然后用無(wú)菌水沖洗3-4次，以完全去除消毒劑；2)酶解，用一把鋒利的鑷子小心地將葉子的下表皮撕掉，切成2厘米長(zhǎng)的小塊，然后放入含酶溶液中進(jìn)行處理(注意：將去皮的一面朝下，在25 28下進(jìn)行酶解反應(yīng)3 4小時(shí)，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿幾次)，3)純化，將酶解懸浮液過(guò)300 400目篩，除去未消化的大塊碎片， 然后將含有原生質(zhì)體的酶溶液收集在離心管中，低速離心，使原生質(zhì)體沉入管底，并將上清液倒入離心管中。 重復(fù)此步驟3次，以完全去除酶解產(chǎn)物；最后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液離心一次，分離、洗滌和純化原生質(zhì)體試劑，分離、洗滌和純化試劑kh2po4 27.2mg kno3 101mg氯化鈣2h2o 1480mg硫酸鎂7h2

7、o 240mg ki 0.16mg硫酸銅5h2o 0.025mg甘露醇13%纖維素酶4%果膠酶0.4%蔗糖- 21% pH 5.6 5.6 5.6，與分離試劑相同，與分離試劑相同；4)原生質(zhì)體活力的測(cè)定：將形態(tài)完整、細(xì)胞質(zhì)豐富、顏色鮮亮的原生質(zhì)體釋放到滲透壓濃度降低的洗滌液或培養(yǎng)基中，可以看到分離后，被還原的原生質(zhì)體將恢復(fù)到原來(lái)的狀態(tài)，成為正常膨脹的、通常是活性的原生質(zhì)體。染色方法：用0.1%的酚藏紅花溶液染色，活原生質(zhì)體可用熒光素二乙酸酯染色，在熒光顯微鏡下觀(guān)察到有熒光的原生質(zhì)體是有活性的。根據(jù)美國(guó)食品和藥物管理局方法的原理，美國(guó)食品和藥物管理局本身沒(méi)有極性，不能發(fā)出熒光，可以自由進(jìn)出細(xì)胞膜

8、。在活細(xì)胞中，食品和藥物管理局被酯酶切割，釋放極性熒光素。熒光素不能自由穿過(guò)質(zhì)膜并在活細(xì)胞中積累。熒光素不能在死細(xì)胞中積累。在紫外線(xiàn)照射下，活細(xì)胞中的熒光素發(fā)出綠色熒光。請(qǐng)想一想，活細(xì)胞和死細(xì)胞，美國(guó)食品和藥物管理局首先用丙酮配制了0.5%的母液，最終濃度為0.01%。原生質(zhì)體分離和純化流程圖，第16章植物原生質(zhì)體融合技術(shù)，植物原生質(zhì)體制備，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)，植物原生質(zhì)體融合，2。植物原生質(zhì)體培養(yǎng)，1。原生質(zhì)體培養(yǎng)法。原生質(zhì)體培養(yǎng)程序。原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵技術(shù)，是固體培養(yǎng)法，根據(jù)一定的細(xì)胞初始密度，在薄層固體培養(yǎng)基中均勻分布。該方法的優(yōu)點(diǎn)是有利于定點(diǎn)觀(guān)察單個(gè)原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)形成和細(xì)胞壁再生的全

9、過(guò)程。淺層液體培養(yǎng)法：將3 4毫升原生質(zhì)體培養(yǎng)液注入培養(yǎng)皿或三角瓶中，然后注入純?cè)|(zhì)體，按一定細(xì)胞密度培養(yǎng)。在固體培養(yǎng)基上，加入適合原生質(zhì)體細(xì)胞壁再生和細(xì)胞分裂的液體培養(yǎng)基。1.原生質(zhì)體培養(yǎng)法。原生質(zhì)體培養(yǎng)程序，細(xì)胞壁再生：體積擴(kuò)大，葉綠體重新排列，新的細(xì)胞壁開(kāi)始合成，細(xì)胞從球形變成橢圓形。細(xì)胞分裂形成細(xì)胞團(tuán)：通常，在培養(yǎng)2-3天后，細(xì)胞質(zhì)增加，細(xì)胞器增殖，DNA和蛋白質(zhì)合成增加，細(xì)胞分裂，形成小細(xì)胞團(tuán)，并發(fā)展成愈傷組織或胚狀體。器官形成和植物再生：胚狀體發(fā)育是由愈傷組織誘導(dǎo)的。3。原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵技術(shù)和影響原生質(zhì)體活力的因素：原生質(zhì)體的制備方法、滲透壓穩(wěn)定劑的種類(lèi)和濃度、質(zhì)膜穩(wěn)定劑的

10、種類(lèi)和濃度、溫度和保溫時(shí)間。原生質(zhì)體密度的初始密度一般為104-105個(gè)細(xì)胞/毫升。細(xì)胞壁再生速度、植物種類(lèi)和材料的生理狀態(tài)；細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)期；原生質(zhì)體培養(yǎng)環(huán)境：光照、溫度、濕度，第16章植物原生質(zhì)體融合，植物原生質(zhì)體培養(yǎng)的制備，植物原生質(zhì)體融合，綜述：動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)介紹，親本來(lái)源，融合方法，融合細(xì)胞的篩選，融合細(xì)胞的克隆，融合細(xì)胞的鑒定，3。植物原生質(zhì)體融合，1。植物細(xì)胞融合的概念和意義。植物細(xì)胞融合程序。誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法和融合劑。細(xì)胞融合的影響因素。細(xì)胞雜種的選擇和鑒定，1。植物細(xì)胞融合的概念和意義，細(xì)胞融合的概念：也稱(chēng)為細(xì)胞雜交：在體外以無(wú)性方式將不同細(xì)胞人工融合成雜交細(xì)胞的技術(shù)。細(xì)胞

11、融合的意義：克服種屬以上植物的有性雜交不親和性障礙，為攜帶外源遺傳物質(zhì)的大分子進(jìn)入細(xì)胞創(chuàng)造條件。2。植物細(xì)胞融合的程序，原生質(zhì)體分離的分離和純化，融合方法的選擇，雜種細(xì)胞的篩選，愈傷組織形成，器官分化，植物再生，雜種植物的鑒定。3。誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法和融合劑鹽融合法高鈣高酸堿度融合法聚乙二醇融合法聚乙二醇結(jié)合高鈣高酸堿度融合法電融合法，綜述：誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞融合的方法，1。病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞融合2?；瘜W(xué)融合劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合3。電融合法，a .鹽融合法，鹽融合劑硝酸鹽：亞硝酸鈉，硝酸鉀，氯化鈣：氯化鈉，氯化鈣，氯化鎂，氯化鋇葡聚糖硫酸鹽：葡聚糖硫酸鉀，葡聚糖硫酸鈉鹽優(yōu)缺點(diǎn)：鹽融合劑對(duì)原生質(zhì)體活力的破壞

12、能力小缺點(diǎn)：融合頻率低，不易誘導(dǎo)融合到液泡化原生質(zhì)體中加入0.05毫升/毫升二氧化氯和0.4毫升/升甘露醇；用甘氨酸鈉緩沖溶液的酸堿度至10.5，形成融合液，在37下保溫0.5小時(shí)；用0.4毫升甘露醇清洗高氯化鈣和高酸堿度；兩種原生質(zhì)體的融合率達(dá)到10%。聚乙二醇是一種分子量為200-20000的高分子化合物。融合機(jī)制可能是由于帶有大量負(fù)電荷的聚乙二醇分子與鈣離子連接下的原生質(zhì)體表面負(fù)電荷之間形成靜電鍵，促進(jìn)異質(zhì)原生質(zhì)體之間的粘附，然后用培養(yǎng)基緩慢稀釋聚乙二醇，最后洗去聚乙二醇，得到10%的異核體。聚乙二醇結(jié)合高鈣和高酸堿度，先用聚乙二醇處理30分鐘；(聚乙二醇是相鄰原生質(zhì)體表面之間的分子橋)

13、然后用高鈣和高酸堿度的溶液稀釋聚乙二醇；(引起原生質(zhì)體表面電荷的無(wú)序和再分布，從而促進(jìn)融合)，用培養(yǎng)液洗去高Ca2和高酸堿度，用聚乙二醇誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合過(guò)程，電融合法，原理：改變?cè)|(zhì)體膜表面的電荷，改變氧化還原電位，使異質(zhì)原生質(zhì)體結(jié)合并瞬時(shí)破裂質(zhì)膜，然后開(kāi)始連接質(zhì)膜直至閉合并形成完整的膜形成融合。優(yōu)點(diǎn)：原生質(zhì)體損傷小，融合率高，重復(fù)性強(qiáng)；該裝置精巧、方便、簡(jiǎn)單，可以在顯微鏡下觀(guān)察或記錄融合過(guò)程，從而省去了聚乙二醇誘導(dǎo)后的洗滌過(guò)程，誘導(dǎo)過(guò)程可控性強(qiáng)。在電融合的基本過(guò)程中，將制備好的親本原生質(zhì)體混合均勻并放入融合室。微電極型只有一個(gè)室，平行電極型有四個(gè)室，兩個(gè)電極之間的距離為3毫米。整個(gè)裝置放在

14、培養(yǎng)皿中。微電極型：當(dāng)用5-12微安的脈沖電流進(jìn)行1-5毫秒的間歇刺激時(shí)，原生質(zhì)體將在幾秒到幾十秒內(nèi)發(fā)生短暫收縮，并有兩層膜。形成囊泡，通過(guò)點(diǎn)與表面連接，最后形成融合體。整個(gè)過(guò)程大約需要10-30分鐘。平行多電極融合裝置法：1兆赫交流電場(chǎng)產(chǎn)生雙向電脈沖，如150伏/厘米，原生質(zhì)體在電場(chǎng)力的作用下極化產(chǎn)生偶極子，原生質(zhì)體緊密排列成珠。在適當(dāng)時(shí)間和強(qiáng)度的DC脈沖(50ms，1.2-2KV/cm)作用下，質(zhì)膜破裂，進(jìn)一步形成融合，細(xì)胞電融合過(guò)程，原生質(zhì)體融合過(guò)程包括三個(gè)主要階段：1)兩個(gè)或兩個(gè)以上原生質(zhì)體的質(zhì)膜相互靠近；2)局部質(zhì)膜緊密粘附并相互融合；3)融合完成，形成球形異核體或同核體。細(xì)胞融合的影響因素，聚乙二醇誘導(dǎo)法：聚乙二醇規(guī)格，純度，作用時(shí)間電誘導(dǎo)法：原生質(zhì)體密度交流電壓交變電場(chǎng)振幅頻率交變電場(chǎng)處理時(shí)間DC高頻電壓脈寬脈沖次數(shù)，5雜交細(xì)胞選擇和鑒定，A，融合型B，雜交細(xì)胞選擇法C，細(xì)胞雜交鑒定，A，融合型， 自體融合：一種發(fā)生在親本原生質(zhì)體同源融合中的細(xì)胞雜種：一種具有雙親染色體的完整集合且部分和諧的細(xì)胞雜種：在雙親染色體逐漸被排斥后，少量染色體重組，然后進(jìn)入同步分裂，最后形成具有部分重組染色體的植物異質(zhì)體細(xì)胞雜種：雙親的所有染色體都被排斥，但細(xì)胞質(zhì)是雙親的嵌合細(xì)胞雜種； 不同種類(lèi)的親本原生質(zhì)體經(jīng)歷了膜融合和細(xì)胞質(zhì)融