免疫組化講課-原理及方法.ppt

1、免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及方法,北京友誼醫(yī)院病理科 黃受方,免疫組織化學(xué)技術(shù)的原理及其方法,一. 基本知識 二. 基本原理 三. 方法 四. 結(jié)果的判斷及異常著色原因分析和對策,一、免疫組化技術(shù)的基本知識,一、 免疫組化技術(shù)的基本知識,免疫組化的基本概念 利用抗原-抗體特異性結(jié)合原理檢測抗原或抗體一般是用抗體檢測抗原 抗原 兩個(gè)主要屬性：免疫原性及特異反應(yīng)性，蛋白質(zhì)具有抗原性 抗體 與抗原能特異性結(jié)合生物學(xué)結(jié)合是免疫球蛋白Ig,免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖,免疫球蛋白根據(jù)重鏈結(jié)構(gòu)命名 IgG(), IgA()，IgD(), IgE(), IgM() 五種免疫球蛋白只有兩種類 型的輕連，即： K

2、appa()和Lambda() 每個(gè)抗體分子的輕鏈必須相同；某一單獨(dú)的抗體分子 決不可能既有鏈又有鏈。這一點(diǎn)在免疫組化的淋巴瘤診斷中十分重要。,免疫球蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其模式圖,Fc(Fragment crystalline) 是免疫球蛋白的羧基端，意為結(jié)晶片段，因其純化時(shí)呈結(jié)晶狀態(tài)而名之，該片段與抗原特異性有關(guān) Fab(Fragment antigen bingding) 該端是抗體與抗原特異性結(jié)合的部位，每分子Ig能結(jié)合2個(gè)抗原分子,Fc Fab Ag,多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生,多克隆抗體：多株B細(xì)胞針對多個(gè)抗原決定簇產(chǎn)生的抗體 單克隆抗體：針對某一抗原決定簇，由單株淋巴細(xì)胞（克隆）所

3、產(chǎn)生的抗體,多克隆抗體,單克隆抗體,多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生,多克隆抗體的產(chǎn)生 以純化的抗原免疫動物而獲得，實(shí)際上是針對多個(gè)抗原決定簇的多個(gè)抗體組成，檢測范圍廣。在病理診斷中，有利劃歸腫瘤的基本類型。 常用的多克隆抗體一般在兔身上產(chǎn)生，國外產(chǎn)品目錄上常以RaH（Rabbit against Human）表之。 多克隆抗體亦可產(chǎn)生于羊、豬、豚、鼠等。弄清一抗多克隆抗體的動物來源種類，對后繼抗體的選用至關(guān)重要。,多克隆抗體與單克隆抗體及其產(chǎn)生,單克隆抗體的產(chǎn)生 應(yīng)用細(xì)胞融合的雜交瘤技術(shù)（Hybridization），以針對單一抗原決定簇的小鼠與小鼠骨髓瘤細(xì)胞（腫瘤性B細(xì)胞）融合形成雜交瘤，其

4、特點(diǎn)是既能產(chǎn)生特異性抗體，又能在體外無限地增殖。將瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)或注入小鼠腹腔內(nèi)而獲單克隆抗體，由此產(chǎn)生的小鼠抗人（抗原）的抗體常以MaH表示，現(xiàn)在亦有兔的單克隆抗體,免疫小鼠Mouse,抗原的制備： 傳統(tǒng)用蛋白提純 近來可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)：已知抗原的基因結(jié)構(gòu)，用其合成多肽，作為抗原，如ER、PR抗原的制備 現(xiàn)有兔的單抗,多克隆抗體和多克隆抗體的選用 單克隆抗體的制備比多克隆抗體復(fù)雜，價(jià)格更貴；在應(yīng)用中不一定比多克隆抗體好。 單克隆抗體的特異性強(qiáng)，多克隆抗體則敏感性高，為何使用完全決定于使用的目的性,市售抗體的種類 某些抗體既有多克隆抗體也有單克隆抗體，如角蛋白，一些抗原只有多克隆抗體，如

5、-胰蛋白酶 有些抗體的抗原來自動物，利用動物與人抗原之間的共同抗原性使該種抗體能應(yīng)用于人的檢測。如Desmin來源于雞的肌肉 近年來,市售單克隆抗體除小鼠源性外，還有兔源性,標(biāo)記抗體,在抗體上用化學(xué)方法聯(lián)接某種標(biāo)記物，目的是使抗原抗體的結(jié)合能用肉眼觀察到 標(biāo)記物種類：熒光素：異硫氰酸熒光素或羅丹明 酶：辣根過氧化酶，鹼性磷酸酶 金屬離子：膠體金顆粒 標(biāo)記的方法：化學(xué)性結(jié)合將降低抗體效價(jià)及標(biāo)記物的活性，從而使染色敏感性降低,酶 抗酶抗體復(fù)合物,通過免疫反應(yīng)而不是化學(xué)方法，將酶結(jié)合到抗體上，形成具酶活性的免疫復(fù)合物。如PAP復(fù)合物（Peroxidase AntiPeroxidase Complex

6、），PAP復(fù)合物屬非標(biāo)記性，保護(hù)了酶的活性，比免疫熒光法敏感上千倍。,親和素生物素復(fù)合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）,親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合 親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性 AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中,酶標(biāo)親和素（Labelled streptavidin）,在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生

7、物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,多聚物載體,一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKO EPOS及DAKO Envision試劑 核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用 一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物,一步法：EPOS,tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule,二步法：EnVision,葡萄球菌蛋白A （Staphy

8、lococcal protein A, SPA）,二、免疫過氧化物酶染色技術(shù)的基本原理,免疫過氧化酶染色技術(shù)的基本原理,識別系統(tǒng),特異性抗體識別組織或細(xì)胞中的靶抗原。特異性抗體具有識別并結(jié)合靶抗原的功能，這是本技術(shù)的理論依據(jù)所在 特異性抗體品種繁多，應(yīng)根據(jù)待檢測抗原的要求選用 特異性抗體有的屬單抗，有的屬多抗，有的既有單抗又有多抗，可根據(jù)不同染色要求而選用 識別系統(tǒng)的組成比較恒定，識別功能由特異的第一抗完成,顯示系統(tǒng),也是顯色系統(tǒng)?？贵w抗原的結(jié)合是肉眼看不見的，顯示系統(tǒng)的目的就是使這種看不見的反應(yīng)變?yōu)榭吹靡?，從而確定抗原的存在及其定位 顯色系統(tǒng)由酶、底物加上顯色劑組成，最終可在標(biāo)記位點(diǎn)形成有色

9、分子的終末產(chǎn)物，若顯色劑為DAB，則出現(xiàn)棕褐色細(xì)顆粒沉淀 E(酶)+S(底物) ES(酶底物復(fù)合物) P(反應(yīng)產(chǎn)物) + E(酶) 循環(huán)使用,顯示系統(tǒng),辣根過氧化酶的免疫組化染色的反應(yīng)過程: HRP + H2O2 HRPH2O2 有色分子終末產(chǎn)物 + HRP DAB（電子供體） HRP：酶 H2O2：底物 HRPH2O2：酶底物復(fù)合物,免疫過氧化酶染色的多種方法中，其主要的不同點(diǎn)在于顯色系統(tǒng)的差異： 間接酶標(biāo)法：利用標(biāo)記于橋聯(lián)抗體的酶 PAP法： 利用PAP復(fù)合物 ABC法： 利用AB復(fù)合物 LSAB法: 利用直接標(biāo)記于親和素的酶 EPOS一步法及EnVision二步法：多聚物載體,其目的都是

10、設(shè)法提高免疫組化染色的敏感性,顯示系統(tǒng),聯(lián)結(jié)系統(tǒng),聯(lián)結(jié)或橋聯(lián)抗體（一般為第二抗體） 按免疫學(xué)要求將識別系統(tǒng)與顯色系統(tǒng)聯(lián)結(jié)成為統(tǒng)一體 應(yīng)采用何種聯(lián)結(jié)抗體決定于特異性第一抗體是多克隆還是單克?。?若一抗是多克隆抗體，則二抗是羊或其它動物的抗兔血清； 若一抗是單克隆抗體，則二抗常是兔抗鼠的血清 有的聯(lián)結(jié)抗體既能聯(lián)結(jié)多抗，亦能聯(lián)結(jié)單抗,三、免疫組化染色方法的類別,免疫組化染色方法的類別,直接法 間接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS） 兩步法（Envision）,直接法,將熒光、酶、金直接標(biāo)記在一抗上進(jìn)行顯色，沒有聯(lián)結(jié)系統(tǒng)、未用橋抗體。 優(yōu)點(diǎn)：特異性高、非特異染色輕。 缺點(diǎn)：敏感性低

11、，要求抗體濃度高。每種一抗均需用酶來標(biāo)記,間接法,將標(biāo)記物標(biāo)記在橋聯(lián)抗體上（即二抗、三抗） 一抗往往是兔身上產(chǎn)生的多克隆抗體，其酶標(biāo)抗體必須是針對兔 優(yōu)點(diǎn)：敏感性高，只需少數(shù)幾種動物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺點(diǎn)：特異性差,Primary Antibody,PAP法（Peroxidase-AntiPeroxidase，過氧化酶-抗過氧化酶法）,組成： 一抗是針對靶抗原的特異性抗體 二抗是聯(lián)結(jié)抗體，一面聯(lián)結(jié)一抗，另一面聯(lián)結(jié)PAP復(fù)合物 三抗是以過氧化物酶為抗原，在與一抗同種動物身上誘發(fā)產(chǎn)生的抗體，并與辣根過氧化物酶形成復(fù)合物（PAP）,PAP法（Peroxidase-AntiPeroxida

12、se，過氧化酶-抗過氧化酶法）,優(yōu)點(diǎn)： PAP復(fù)合物中含酶更多，且是一種非標(biāo)記的免疫組化方法，敏感性更高 PAP復(fù)合物常來自兩種不同的動物（鼠、兔），鼠PAP用于一抗為單克隆抗體的染色，兔PAP多用于一抗為多克隆抗體的染色 可用于福爾馬林固定的石蠟切片,PAP,Primary Antibody,Secondary Antibody,Peroxidase-anti-Peroxidase,ABC法（Avidin-Biotin Complex，親和素-生物素法）,組成： 一抗、生物素化的二抗、ABC復(fù)合物（親和素+酶標(biāo)生物素） 優(yōu)點(diǎn)： 親和素和生物素有強(qiáng)大親和力，使其比直接和間接酶標(biāo)法更敏感，也超過

13、PAP法。 能用于常規(guī)石蠟切片。,親和素生物素復(fù)合物（ Avidin-Biotin Complex ABC ）,親和素有四個(gè)生物素分子特異性結(jié)合部位，其結(jié)合力強(qiáng)，不可逆，還可和辣根過氧化酶或熒光素等結(jié)合 親和素-生物素復(fù)合物是一個(gè)三維空間的結(jié)構(gòu)，它利用親和素為中介，一端通過生物素化的抗體聯(lián)接第一抗體，另一端通過生物素化酶與顯色系統(tǒng)相連接，產(chǎn)生多級放大，從而提高此生物反應(yīng)的敏感性和特異性 AB復(fù)合物多用于ABC法的免疫組化中,ABC法（Avidin-Biotin Complex，親和素-生物素法）,一抗,二抗,ABC,DAB,ABC,ABC與PAP 法的比較,LSAB（SP）法（labelled

14、 streptavidin biotin method）標(biāo)記的鏈霉親和素-生物素法,特點(diǎn)：將HRP直接標(biāo)記于鏈霉親和素上 優(yōu)點(diǎn)： 更快速：空間結(jié)構(gòu)更小 更敏感：鏈霉親和素的親和性更強(qiáng)，更易于到達(dá)深部位點(diǎn) 非特異背景更少：鏈霉親和素空間結(jié)構(gòu)特殊，不易與高荷電的組織成分（膠原纖維、結(jié)締組織）聯(lián)結(jié),酶標(biāo)親和素（Labelled streptavidin）,在AB復(fù)合物中，酶是標(biāo)記在生物素上，而后與親和素合成復(fù)合物。在標(biāo)記的親和素-生物素方法中是將辣根過氧化酶直接標(biāo)記在親和素上，辣根過氧化酶與親和素間有極強(qiáng)的結(jié)合力，因此LSAB法比ABC法更敏感,SP,Primary Antibody,Biotiny

15、lated Secondary Antibody,Ensyme-conjugated Streptavidin,ABC與LSAB(SP)法的比較,一步法（EPOS）及兩步法（Envision）,特點(diǎn) 以多聚體為載體，聯(lián)結(jié)了酶和一抗（一步法）或二抗的Fab段和酶（二步法） 優(yōu)點(diǎn) 操作簡便，省時(shí) 提高了敏感性和特異性 減少了背景著色 避免內(nèi)源性生物素的干擾,多聚物載體,一步法及二步法載體試劑，可分別稱DAKO EPOS及DAKO Envision試劑 核心是一種柔韌的多聚物，它能結(jié)合一抗和酶分子，起到載體的作用 一步法多聚物載體試劑是多聚物結(jié)合特異性一抗和辣根過氧化酶，二步法多聚物載體試劑是一種能

16、與二抗相聯(lián)結(jié)的由HRP標(biāo)記的多聚物,一步法：EPOS,tissue antigen dextran backbone primary antibody enzyme molecule,二步法：EnVision,一步法（EPOS）及兩步法（Envision）比較,EPOS一步法,Primary Antibody,EnVision二步法,四、免疫組化染色結(jié)果的判斷及異常著色的原因分析及其對策,特異性著色具備特點(diǎn) 特定的組織 特定的定位 特定的細(xì)胞 特定的細(xì)胞內(nèi)的部位 分布上的不均一 著色的不均一性 著色強(qiáng)度的不均一 顆粒性顯色：DAB顯色劑應(yīng)為棕黃到棕褐色,免疫組化染色結(jié)果的判斷,CK染色，結(jié)腸腺

17、癌細(xì)胞膜特異性著色,Kappa 胞漿著色,TdT染色，胞核著色,PR 胞核著色,ER 胞核著色,免疫組化染色結(jié)果的判斷,對照的設(shè)置 空白對照 陽性對照 吸收試驗(yàn)對照 替代對照 自身對照,異常著色（假陽性）原因及對策,異常著色原因,內(nèi)源酶及內(nèi)源性生物素 抗體本身原因 切片制作不當(dāng) 沖洗不充分 DAB顯色產(chǎn)生背景著色,抗原的丟失 抗原的遮蔽 抗體試劑因素 操作不當(dāng),假陰性的原因,內(nèi)源酶及內(nèi)源生物素,非特異性著色原因及對策,滅活過氧化物酶-3%H2O2 滅活內(nèi)源性生物素-蛋清封閉或更換不含生物素的染色系統(tǒng) 滅活堿性磷酸酶,Desmin,異常著色原因及對策,S-100,異常著色原因及對策,異常著色原因及對策,清洗不充分,用含鹽的緩沖液充分沖洗，可利于減低背景著色,DAB顯色產(chǎn)生背景著色,未除去DAB的不溶性顆粒 DAB保存不妥，其氧化產(chǎn)物沉淀在組織上,電荷吸附,加二抗動物非免疫血清 牛血清也常用,非特異性背景著色原因及對策,假陰性的原因分析及對策,抗原的丟失 標(biāo)本固定不及時(shí)、固定過久，浸蠟時(shí)間、溫度過高