《液體內(nèi)沉淀試驗》PPT課件

1、,第六章 沉淀反應(yīng),第六章 沉淀反應(yīng),第一節(jié) 沉淀反應(yīng)的特點 第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗 一、絮狀沉淀試驗 二、免疫濁度測定,第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗 一、單向擴散試驗 二、雙向擴散試驗 第四節(jié) 免疫電泳技術(shù) 一、對流免疫電泳 二、火箭免疫電泳 三、免疫電泳 四、免疫固定電泳,思考題 小結(jié),第一節(jié) 沉淀反應(yīng)原理及特點,沉淀反應(yīng)（precipitation）是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當條件（PH、電解質(zhì)等）下發(fā)生特異性結(jié)合而出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象,其特性與經(jīng)典的抗原抗體反應(yīng)相同。,1898年Kraus首次發(fā)現(xiàn)毒素-抗毒素的沉淀現(xiàn)象； 1905年Bechgold 發(fā)現(xiàn)沉淀可以在明膠中進行； 1965年Mancin

2、i發(fā)明單向免疫擴散技術(shù)； 上世紀70年代免疫濁度法出現(xiàn)。 上述技術(shù)的發(fā)明發(fā)展，使得沉淀反應(yīng)向快速、準確、微量、自動化方向發(fā)展，在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用越來越廣泛。,形成肉眼可見的大的免疫復(fù)合物。沉淀線或沉淀環(huán)的觀察以及免疫比濁法中的終點法就是測定此階段形成的復(fù)合物,第一階段,第二階段,沉淀反應(yīng)分兩個階段,抗原抗體特異性結(jié)合，快速但不可見。免疫比濁法中的速率法就是利用此階段測定免疫復(fù)合物形成的速率。,經(jīng)典的沉淀反應(yīng)在第二階段觀察或測量沉淀線或沉淀環(huán)等來判斷結(jié)果，稱為終點法需要幾十分鐘到數(shù)小時； 在第一階段測定免疫復(fù)合物形成的速率，稱為速率法。,免疫濁度測定 絮狀沉淀試驗,單向擴散試驗 雙向擴散試驗,對

3、流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫電泳 免疫固定電泳,液體內(nèi)沉淀試驗,凝膠內(nèi)沉淀試驗,凝膠免疫電泳技術(shù),沉淀反應(yīng)可分三類,第二節(jié)液體內(nèi)沉淀試驗,絮狀沉淀試驗是將抗原與相應(yīng)抗體混合，在電解質(zhì)存在的條件下，抗原抗體結(jié)合形成肉眼可見的絮狀沉淀物。 方法受抗原抗體比例的影響非常明顯 應(yīng)用于測定抗原抗體反應(yīng)的最適比例 (三種類型),一、 絮狀沉淀試驗,抗原稀釋法：抗原最適比例,抗體稀釋法：抗體最適比例,方陣滴定法：抗原抗體最適比例,絮狀沉淀試驗,將抗原作系列稀釋，與恒量濃度的抗血清等量混合反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗原量的變化而不同?？乖贵w比例適當時，形成的沉淀物最多。,將抗體作系列稀釋，與恒量濃度的抗血清等

4、量混合反應(yīng)后，產(chǎn)生的沉淀物隨抗體量的變化而不同。,將以上兩種方法結(jié)合，將抗原抗體同時稀釋，找出最佳比例。,表6-1 最適比方陣測定法,當可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度的改變。利用現(xiàn)代光學(xué)測量儀器與自動化檢測分析相結(jié)合對濁度進行測定從而檢測微量抗原或抗體。,原 理,二、免疫濁度測定,1.抗原抗體的比例：反應(yīng)體系中保持抗體過量 高劑量鉤狀反應(yīng)(high dose hook effect)：當抗原過剩時，形成的IC分子小，而且容易離解，濁度反而下降。 用抗體檢測抗原，當反應(yīng)液中抗體過量時，在一定范圍內(nèi)，IC的形成

5、量與抗原量的遞增正比，當抗原量遞增至抗原抗體最佳比例時，IC的形成到達高峰。如再增加抗原量，IC的形成量反而減少。因此，如檢測時抗原過量則得出錯誤的檢測結(jié)果。 反應(yīng)體系中保持抗體過量。 2.抗體的質(zhì)量 ：特異性強，效價高，親和力強并使用R型抗體(等價帶寬) 3.抗原抗體反應(yīng)液的最適PH為6.58.5 4.使用增濁劑,影響因素,免疫濁度測定,1.透射免疫比濁法 2.散射免疫比濁法 3.免疫膠乳比濁法,分類,免疫濁度測定,經(jīng)典的沉淀試驗有四個缺點無法克服：操作繁瑣；靈敏度低(10-100g)；時間長；難以自動化。,第三節(jié)凝膠內(nèi)沉淀試驗,可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體相遇

6、并且濃度比例適當?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙烯酰胺凝膠。 要求：1、單價特異性抗血清（是指血清只與其特異性抗原發(fā)生反應(yīng)）； 2、標準品； 3、靈敏度1.25g/ml,原理,原理：抗體與待測的抗原,在兩者比例合適的部位結(jié)合形成沉淀環(huán)。 環(huán)的大小與抗原的濃度成正相關(guān)。,技術(shù)要點：將抗體混入0.9%瓊 脂糖內(nèi)（50），未凝固前傾 注成平板，凝固后打孔（直徑 35mm ），孔中加入抗原溶 液和不同濃度的標準品，置濕 盒內(nèi)37,2448h 觀察孔周 圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。,定量試驗,一、單向擴散試驗 （平板法）,傾注平板打孔加樣 放置372448h觀察沉淀環(huán),

7、單向擴散試驗（平板法）,沉淀環(huán)的直徑與待測標本含量兩種計算方法,Mancini曲線： 大分子抗原（IgM） 時間擴散48h， 常數(shù)KCd2 普通坐標紙曲線,Fahey曲線： 小分子抗原（IgG,IgA） 擴散時間24h 常數(shù)KlogCd 半對數(shù)坐標紙曲線,C為抗原濃度， d為沉淀環(huán)直徑,單向擴散試驗 （平板法）,T1為1624h；T2為2448h；T3為48h以上,可見T3為直線，T1為反拋物線,t1為1624h；t2為2448h；t3為48h以上,可見t1為直線，t3為反拋物線,Mancini曲線,Fahey曲線,影響因素： 抗體質(zhì)量 標準曲線 ，質(zhì)控血清 結(jié)果與真實含量不符 單克隆抗體+多

8、態(tài)性抗原=假性降低； 多克隆抗體+單克隆病=假性升高； 雙環(huán)現(xiàn)象 抗原性相同、擴散率不同的兩個組分：重鏈病人血清中的重鏈與正常IgA,單向擴散試驗 上排為5個不同濃度的參考品； 下排為患者血清，下排右2為異常病理血清,單向擴散試驗 （平板法）,原理：將抗原抗體分別加在瓊脂糖不同的對應(yīng)孔中，兩者在凝膠中自由擴散，在比例合適處形成白色沉淀線。,技術(shù)要點：平板玻璃上傾注一層均勻的瓊脂糖薄層，凝固后打孔，孔徑為3mm，孔間距在35 mm之間，在相對的孔中加入抗原或抗體，放置濕盒371824h 后，觀察孔周圍是否出現(xiàn)沉淀環(huán)。,鑒定抗原抗體的最基本、最常見的方法之一,二、雙向擴散試驗 （平板法）,1. 抗

9、原或抗體的存在與否以及相對含量(位置)的估計,2.抗原或抗體相對分子量（形狀）的估計,雙向擴散試驗 （平板法）,應(yīng)用,3.抗原性質(zhì)的分析,雙向擴散試驗 （平板法）,Ab,Ab,Ab,應(yīng)用,4.抗體效價的滴定,5.抗原或抗體純度 的鑒定 : MixAg+Ab / MixAb+Ag = one band(pure)/ several band(impure),雙向擴散試驗 （平板法）,簡單易行，用途廣泛； 靈敏度低1.25g/ml，反應(yīng)慢，不能精確定量,雙向擴散試驗 （平板法）,第四節(jié)免疫電泳技術(shù),優(yōu)點： 1.加快反應(yīng)的速度。 2.提高了靈敏度（g/ml）。 3.增加了分辨率。,電泳分析,沉淀反應(yīng)

10、,抗原抗體反應(yīng) 的高度特異性,電泳技術(shù)的高 分辨率、快速、 微量,免疫電泳技術(shù),原理：雙向擴散 + 電泳 比雙向擴散試驗靈敏度提高816倍,技術(shù)要點：制備1.2%巴比妥 瓊脂凝膠板，在其上成對打 孔，孔徑3mm，孔距6 mm， 于陰極側(cè)孔內(nèi)加待測血清， 陽性側(cè)孔加抗血清，電泳條 件34mA/cm，30min1h，pH8.6 buffer。,一、對流免疫電泳,蛋白質(zhì)抗原常帶較強的負電荷，在電場中向正極移動,抗體球蛋白(PI6-7) 帶負電荷較少，籍電滲(水流)作用向負極泳動,對流免疫電泳,IgG3/IgG4,IgG1/IgG2,結(jié)果分析： 無沉淀線出現(xiàn)則表明無相應(yīng)的抗原。 沉淀線位于抗原抗體孔中

11、間，說明兩者比例較適合。 沉淀線偏向抗原孔一方，表示抗體濃度抗原，反之，則是抗體濃度抗原濃度。,對流免疫電泳,+,+,+,電泳時凝膠中抗體不移動，樣品孔中的抗原向正極泳動，隨著抗原量的逐漸減少，抗原泳動的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個形狀如火箭的不溶性復(fù)合物沉淀峰，抗體濃度固定時，峰的高度與抗原量呈正相關(guān)。,原理,單向免疫擴散電泳,定量檢測技術(shù),二、火箭免疫電泳,1.2%巴比妥瓊脂糖約55，加入適量抗血清，混勻后制板，打孔，孔內(nèi)加待測樣品，樣品孔放負極側(cè)， 6h后觀察瓊脂板上沉淀峰，繪制標準曲線，求出待測樣品濃度。,技術(shù)要點,火箭免疫電泳,火箭免疫電泳示意圖,

12、沉淀峰高,抗原濃度,1.測定沉淀峰高度 2.在標準曲線上查找 相應(yīng)抗原濃度,繪制標準曲線,染色標本結(jié)果,火箭免疫電泳,1.瓊脂（無電滲或電滲很小的）影響火箭形狀不規(guī)則。 2.電泳終點時間的確定（云霧狀、圓形火箭窄峰）。3.標本數(shù)量多時應(yīng)先通電后加樣,防止寬底峰形. 4.IgG定量時，可用甲醛與IgG上的氨基結(jié)合（甲?；粠ж撾姾?，抵消了電滲作用。,影響因素,火箭免疫電泳,提高靈敏度：免疫自顯影技術(shù)（加入125I標記的標準抗原，免疫競爭性法檢測目的抗原）,原理：區(qū)帶電泳雙向擴散 1、將蛋白質(zhì)抗原在凝膠中電泳分成肉眼不可見的若干區(qū)帶 2、沿電泳方向挖一與之平行的抗體槽，加入相應(yīng)抗血清進行雙向擴

13、散 。,技術(shù)要點：制備瓊脂板 打孔，加樣于孔內(nèi)，電泳23mA/cm ，0.51h后，槽內(nèi)加入相應(yīng)抗血清作雙向擴散。,三、免疫電泳,純化抗原和抗體成分的分析及正常和 異常免疫球蛋白的識別與鑒定,影響因素,抗原抗體比例不當,需測抗原抗體最適比,抗血清的的抗體譜 ，混合抗血清的使用,電泳條件直接影響分辨率,應(yīng)用,免疫電泳,免疫電泳示意圖,骨髓瘤血清,正常人血清,Albumin,Alpha 1,Alpha 2,Beta,Gamma,免疫電泳原理，不同之處是將抗血清直接加于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原抗體在凝膠中直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，在適當位置形成抗原抗體復(fù)合物，經(jīng)染色后，可對各類免疫球蛋白及其輕鏈進行分型

14、,原理,區(qū)帶電泳沉淀反應(yīng),四、免疫固定電泳,先將患者血清或血漿(未變性)在醋纖膜或瓊脂上作區(qū)帶電泳，根據(jù)血清蛋白質(zhì)的電荷不同將其分開，然后將IgG、IgA、IgM、輕鏈和輕鏈的抗血清加于分離的蛋白質(zhì)泳道，參考泳道則加蛋白質(zhì)固定劑，用于區(qū)帶對照，作用一定時間后洗去游離蛋白質(zhì)，染色后則可見被固定的相應(yīng)M蛋白成分。,技術(shù)要點,免疫固定電泳,左圖為IgG 型, 中圖為IgG 型，右為正常（無單鏈）,免疫固定電泳示意圖,Antibody:,分辨率強，敏感度高，操作周期短，僅需數(shù)小時，結(jié)果易于分析。,應(yīng)用,最常用于M蛋白的鑒定與分型，也用于尿中本周氏蛋白質(zhì)的檢測與、 分型，腦脊液中寡克隆蛋白的檢測與分型。

15、,優(yōu)點,免疫固定電泳,M蛋白：經(jīng)免疫電泳及化學(xué)分析證明它是由單克隆漿細胞分泌的結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白或多肽鏈亞單位(輕鏈)，即單克隆免疫球蛋白，或稱M蛋白。,1.主要用于血液、體液中蛋白質(zhì)的測定。 2.優(yōu)點：穩(wěn)定性好，敏感度高，精確度高，簡便快速，易于自動化，無放射性核素污染，適合大批量標本檢測。3.對流免疫電泳與火箭免疫電泳技術(shù)由于電滲的緣故已不推薦使用。 4.免疫電泳擴散時間長，影響因素多，結(jié)果不易分析。 5.免疫固定電泳分辨力強，敏感度高，結(jié)果易于分析，常用于M蛋白的鑒定與分型。,沉淀反應(yīng)在醫(yī)學(xué)檢驗中的應(yīng)用,沉淀反應(yīng)是指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當條件下發(fā)生特異性結(jié)合而出的沉淀現(xiàn)象.根據(jù)沉淀反應(yīng)介質(zhì)和檢測方法的不同，將其分為液體內(nèi)沉淀試驗、凝膠內(nèi)沉淀試驗和凝膠免疫電泳試驗三大基本類型。 免疫濁法度測定為液體內(nèi)沉淀試驗；單向擴散試驗平板法是一種定