遺傳疾病與基因治療ppt課件

1、.,1,遺傳疾病與基因治療,廖宇靜,.,2,遺傳疾病,單基因缺陷 多基因遺傳病 染色體遺傳病 生化遺傳病 線粒體基因病,.,3,單基因缺陷,也稱為孟德爾紊亂（Mendlian disorder）、單基因紊亂（monogentic disorder）或單基因座紊亂（ single locus disorder）。 突變基因：常染色體、性染色體上 可顯性遺傳，也可隱性遺傳。 苯硫脲的嘗味能力的突變就是典型的單基因突變。,.,4,多基因遺傳病,糖尿病 冠狀動脈硬化等,.,5,染色體遺傳疾病,是由染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目變異造成的。其中非整倍體較為常見。 Down綜合征有21三體、46/47嵌合體和易位型（1

2、4；21易位個體）。 Edward綜合征，即18三體。Payau綜合征即13三體。 貓叫綜合征即第五染色體短臂缺失所致。,.,6,生化遺傳病,1902年英國科學(xué)家Archibald Garrod首先報(bào)道了尿黑酸代謝疾病，1909年他出版了先天性代謝差錯一書，在該書中系統(tǒng)地闡述了代謝病的遺傳基礎(chǔ)，以及基因與酶的相互關(guān)系，他把人類生化失調(diào)現(xiàn)象與遺傳規(guī)律緊密地結(jié)合起來。因?yàn)樗墓?，人們尊稱他為先天性代謝研究之父。 尿黑病，是尿黑酸氧化酶缺乏所致。 白化病是酪氨酸酶缺乏，不能形成黑色素所致。 苯丙酮癥是不能形成苯丙氨酸羥化酶，不能將苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為酪氨酸，在血液中積累苯丙氨酸導(dǎo)致苯丙酮癥。 半乳糖血癥

3、是是一種乳糖代謝紊亂，涉及到半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉(zhuǎn)移酶、尿苷二磷酸半乳糖-4-差向異構(gòu)酶等多種酶，其中任何一種酶出現(xiàn)缺陷，都可以導(dǎo)致不同亞型的半乳糖血癥。 生化遺傳病有的是單基因遺傳，有的是多基因遺傳。生化遺傳病多數(shù)是常染色體隱性遺傳，大部分是伴X性隱性遺傳。只有少部分是常染色體顯性遺傳。,.,7,血紅蛋白分子病,1949年L.Pauling發(fā)現(xiàn)廉形細(xì)胞貧血癥中的變異的血紅蛋白S，并第一次提出了分子病的概念。 1959年Ingram等證實(shí)了HbS的結(jié)構(gòu)變異，即血紅蛋白的鏈的第六位氨基酸，由谷氨酸變成了纈氨酸。從那以后到目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血紅蛋白異常的有400多種。 已知的分子病有凝血性

4、疾病、補(bǔ)體系統(tǒng)缺陷、膠原蛋白異常，受體蛋白異常等159種。,.,8,血紅蛋白病大致分類,異常血紅蛋白疾病：有鏈、鏈、鏈和鏈異常的不同種類。 血紅蛋白異常種類有471種， 鏈異常的有144種 鏈異常的有259種 鏈異常的有17種 鏈異常的有42種 同時(shí)涉及兩條鏈異常的有9種。 地中海貧血?。╰halassemias）是由于一種或多種珠蛋白合成速率降低，以致一些肽鏈缺乏，另一些肽鏈相對過剩，出現(xiàn)肽鏈數(shù)量上不平衡，從而導(dǎo)致溶血性貧血。,.,9,異常血紅蛋白疾病原因,單個堿基替換：如異常血紅蛋白HbE是鏈第26位的谷氨酸被賴氨酸取代； 密碼子缺失或插入： HbGrady是鏈第116118插入了谷-苯丙

5、-蘇氨酸所致； 移碼突變： Hb Tak是第146147個氨基酸密碼子之間插入了AC，使終止密碼子UAA變成了蘇氨酸密碼子ACU，肽鏈延長至147個氨基酸。 融合基因： Hb Lepore是非鏈由鏈與鏈連接而成，其中N端為鏈的序列，C端為鏈的序列，這是減數(shù)分裂時(shí)發(fā)生不等交換所致。 終止子突變： Hb constant spring(HbCS)是鏈142位終止密碼子UAA變成CAA，終止密碼子處翻譯成谷氨酰氨，肽鏈一直延長至173個氨基酸。 無義突變：Hb McKees-Rock的鏈丟失了C端的兩個氨基酸，鏈第145個酪氨酸密碼子UAU變成了終止密碼子，所以肽鏈只能合成至144個氨基酸處。,.,

6、10,地中海貧血癥分類,鏈的地中海貧血癥： 鏈地中海貧血癥主要是定位于人的第16號染色體短臂上的兩個連鎖的鏈的珠蛋白基因缺失所致； 鏈的地中海貧血癥： 血紅蛋白鏈的減少或缺失所致。,.,11,線粒體基因病,線粒體基因病是線粒體基因組發(fā)生基因突變所產(chǎn)生的一類遺傳病。其傳遞與表達(dá)不同于核基因遺傳。 遺傳性視神經(jīng)（Leber hereditary neropathy ,LHON）是典型的線粒體基因病。 線粒體呼吸鏈復(fù)合物遺傳異常而引發(fā)的遺傳性疾病。 患者初期為急性或亞急性眼球神經(jīng)炎，隨后引發(fā)嚴(yán)重的雙側(cè)視神經(jīng)萎縮和大片中心暗點(diǎn)，使視力突然喪失，伴隨有色盲障礙。 此病的發(fā)病高峰年齡為2025歲，但在任何

7、年齡都可以發(fā)病，一般無特殊的并發(fā)癥。,.,12,線粒體基因病的原因,是mt DNA發(fā)生了重復(fù)或缺失或點(diǎn)突變，呈現(xiàn)母性遺傳的特點(diǎn)。 線粒體基因疾病的傳遞與發(fā)病機(jī)理還有待進(jìn)一步 研究： 如當(dāng)一個細(xì)胞中大量的線粒體DNA就某個基因座而言，一般是雜性的，原則上不會致病，那么是什么機(jī)理使個別發(fā)生突變的mt DNA在卵細(xì)胞中逐步積累以致使子代發(fā)生線粒體基因病的呢？ 從細(xì)胞質(zhì)的傳遞規(guī)律看，母體傳遞給子代的線粒體的機(jī)會理論上是均等的，但為什么LHON線粒體基因病的患者男性多于女性，對于這些現(xiàn)象尚無合理的解釋。,.,13,人類疾病的基因診斷與基因治療,基因診斷 基因治療 基因治療的成果與展望,.,14,基因診斷

8、,基因診斷又稱為DNA診斷，是利用重組DNA技術(shù)，直接從DNA水平上來檢測人類遺傳性疾病中的基因缺陷，從而作出判斷 基因診斷的基本原理 基因診斷基本技術(shù)及其應(yīng)用,.,15,基因診斷的基本原理,應(yīng)用人類標(biāo)準(zhǔn)基因圖譜或功能蛋白基因基因圖譜與受試者的基因圖譜進(jìn)行比較、分析與預(yù)測，不論缺陷基因是否已經(jīng)表達(dá)，便能鑒定缺陷基因的有無。 能夠檢測單個堿基置換、缺失和插入等 還能發(fā)現(xiàn)DNA的多態(tài)現(xiàn)象以及遺傳病的異質(zhì)性 及早發(fā)現(xiàn)易感基因位點(diǎn),.,16,基因診斷的基本方法,DNA點(diǎn)雜交 限制性內(nèi)切酶圖譜直接分析法 限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析 寡聚核苷酸探針雜交分析法 PCR法,.,17,DNA點(diǎn)雜交,變

9、性： 把受檢者DNA變性成單鏈 轉(zhuǎn)膜雜交：單鏈DNA直接點(diǎn)樣在硝酸纖維膜上，與標(biāo)記的基因探針作固相分子雜交， 檢查結(jié)果：根據(jù)雜交結(jié)果是否是陽性及陽性強(qiáng)度，來檢測基因是否存在以及基因的數(shù)目。 此法的優(yōu)點(diǎn)：比較簡便快捷，可適用于診斷基因缺失的遺傳疾病。 例子：如正常人的細(xì)胞中有4個珠蛋白基因，根據(jù)受檢者DNA與P32標(biāo)記的珠蛋白基因探針雜交后再按放射自顯影圖上的強(qiáng)度與其基因數(shù)量成正比的原理，便可檢測出珠蛋白基因是否缺失和缺失的程度，以確定有無地中海貧血癥及該病的相應(yīng)類型。 技術(shù)的關(guān)鍵：是克隆一批能用于檢測人類遺傳疾病基因診斷的探針，制作成為診斷芯片。,適用于典型遺傳疾病 確知疾病基因 通過芯片探針

10、檢測,.,18,限制性內(nèi)切酶圖譜直接分析法,是應(yīng)用專一性探針和限制酶，直接針對存在疾病基因內(nèi)部的突變進(jìn)行檢測。 可檢測出點(diǎn)突變導(dǎo)致的限制性位點(diǎn)的改變和包括大的DNA片段缺失和插入的基因序列的重排。 例子：限制酶Mst所識別的DNA堿基序列是CCTGAGG，而這是正常珠蛋白基因（A）第六個密碼子前后的堿基序列。 經(jīng)Mst切開形成1.15kb和0.2kb兩個片段。 正常珠蛋白基因突變成為鐮形細(xì)胞貧血癥基因（S）時(shí)，第六個密碼子GAG突變成為GTG，于是CCTGAGG變成CCTGTGG，而不能被Mst所識別，以致酶切時(shí)產(chǎn)生1.35kb的DNA片段。 根據(jù)這一特點(diǎn)，可以對鐮形細(xì)胞貧血癥進(jìn)行基因診斷,突

11、變位點(diǎn)或易感基因,.,19,限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析,利用人群個體的DNA堿基序列的多態(tài)性特征進(jìn)行診斷。 大約每100200個堿基中就有發(fā)生中性替代而出現(xiàn)多態(tài)性。多態(tài)性并不引起疾病，卻影響到限制酶的切點(diǎn)改變。 RFLP呈孟德爾式遺傳， RFLP作為染色體上疾病基因座位的標(biāo)記基因，通過RFLP的連鎖分析，對疾病進(jìn)行間接診斷，來推測一個家庭成員和胎兒是否攜帶有遺傳病。 我國在20世紀(jì)80年代中期已應(yīng)用這一技術(shù)成功地進(jìn)行了地中海貧血病、苯丙酮尿癥等遺傳病的基因診斷。 RFLP連鎖分析是一種十分有用的遺傳病診斷技術(shù)，適用于診斷任何一種單基因遺傳病。 即使突變的遺傳病基因序列或基因產(chǎn)物還不清

12、楚，但只要找到和突變基因連鎖的RFLP基因座，就可以利用RFLP連鎖分析進(jìn)行遺傳病的基因診斷和產(chǎn)前診斷。 有人提出如果建立起一套以20cM間隔的平均分布于整個基因組的RFLP基因座，并選用合適的探針，就有可能對所有的遺傳病進(jìn)行基因診斷。,易感基因，多態(tài)性,.,20,寡聚核苷酸探針雜交分析法,根據(jù)已知疾病基因突變結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的正?；蚪Y(jié)構(gòu)，在體外人工合成一段1619bp的疾病基因探針和同樣大小的相應(yīng)正?；蚱蔚墓丫酆塑账崽结?，并分別與被檢者雜交，從而直接顯示疾病基因是否存在以及存在的狀態(tài)。 這一方法對遺傳病進(jìn)行診斷，既不受突變是否涉及限制酶切位點(diǎn)的限制，又不必預(yù)知患者父母是否生育過患兒，因此在產(chǎn)

13、前診斷中更有價(jià)值。 世紀(jì)年代末，上海兒童醫(yī)院應(yīng)用這一技術(shù)對上海等幾個省市的地中海貧血癥家系進(jìn)行了分析鑒定，并對高危妊娠胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷。,疾病直接診斷,.,21,基因治療,概念：基因治療（ gene therapy）是將具有防治功能的外源基因（目的基因）通過適當(dāng)載體轉(zhuǎn)移到患者的相應(yīng)器官組織（靶組織），并進(jìn)行表達(dá)，以獲得防治疾病的療法。 基本原理： 基因治療是將外源基因作為藥物導(dǎo)入體內(nèi)靶組織，在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生特定的活性因子（如細(xì)胞因子等），也可以將其看做是導(dǎo)入一個具有治療作用的給藥系統(tǒng)。 條件： 1）獲得目的基因； 2）選定靶組織； 3）確定將目的基因?qū)氚薪M織的方法和途徑。,.,22,基因治

14、療途徑,遺傳病的基因治療是指應(yīng)用基因工程技術(shù)將正?；蛑苯右牖颊呒?xì)胞內(nèi)，以糾正致病基因的缺陷而根治遺傳病。 糾正的途徑: 原位修復(fù)缺陷的基因， 用有功能的正常基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞基因組的某一部位，以互補(bǔ)替代缺陷基因來發(fā)揮作用，一般利用基因芯片來實(shí)現(xiàn)。,.,23,基因治療的基本步驟,目的基因獲得 目的基因?qū)牖蜣D(zhuǎn)移 目的基因表達(dá) 目的基因的壽命,.,24,目的基因獲得,疾病基因與疾病修復(fù)基因的比對 人工合成 基因文庫釣取 cDNA合成 PCR合成 制作芯片,.,25,目的基因轉(zhuǎn)移方法,病毒方法 非病毒方法,RNA和DNA病毒都可作為基因轉(zhuǎn)移的載體。 常用的有反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體。 轉(zhuǎn)移的基本過程

15、是將目的基因重組到病毒基因組中，然后把重組病毒感染宿主細(xì)胞，以使目的基因整合到宿主基因組內(nèi)。,磷酸鈣沉淀法 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法 顯微注射法等。,.,26,目的基因的表達(dá),目的基因的表達(dá)是基因治療的關(guān)鍵之一。 可運(yùn)用連鎖基因擴(kuò)增等方法適當(dāng)提高外源基因在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)。 在重組病毒上連接啟動子或增強(qiáng)子等基因表達(dá)的控制信號，使整合在宿主基因組中的新基因高效表達(dá)，生產(chǎn)所需要的特異性蛋白質(zhì)，達(dá)到基因治療的目的。 可利用質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳技術(shù)使其表達(dá)。,.,27,基因治療的方式,體細(xì)胞治療法 生殖細(xì)胞治療法 體外原位基因治療法 體內(nèi)基因治療法 反義療法 核酶治療法,.,28,安全措施,使新基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)后不

16、危害細(xì)胞和人體自身， 不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等， 尤其是在將反轉(zhuǎn)錄載體用于基因轉(zhuǎn)移時(shí)，必須在應(yīng)用到人體前預(yù)先在人骨髓細(xì)胞、小鼠體內(nèi)和靈長類動物體內(nèi)進(jìn)行類似的研究，以確保治療的安全性。,.,29,惡性腫瘤的基因治療,基因治療是腫瘤治療的一個新領(lǐng)域，主要運(yùn)用基因工程技術(shù)來修復(fù)和糾正腫瘤基因的結(jié)構(gòu)與功能的缺陷，或通過增強(qiáng)宿主細(xì)胞對腫瘤的殺傷能力和機(jī)體防止機(jī)制來治療腫瘤。 癌癥基因治療的方案： 一是在體外將細(xì)胞因子導(dǎo)入腫瘤或宿主細(xì)胞，利用細(xì)胞因子對免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的增強(qiáng)，使宿主產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。 二是把某些對化學(xué)藥物敏感的基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，因該基因?qū)λ幬锏拿舾行詮亩g接殺死腫瘤細(xì)胞

17、，目前正在使用的是單純性皰疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因。 三是利用抑癌基因進(jìn)行腫瘤治療。,.,30,基因芯片,基因芯片（gene chip）是利用大規(guī)模集成電路的手段，控制固相合成成千上萬個寡聚核苷酸探針，并把它們有規(guī)律地排列在指甲大小的硅片上，然后將要研究的材料，如DNA或cDNA用熒光標(biāo)記后在芯片上與探針雜交，再通過激光共聚焦顯微鏡對芯片進(jìn)行掃描，并配合計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對每一個探針上的熒光信號作出比較與檢測，從而迅速得出所需要的信息。 克服了Southern技術(shù)操作煩瑣、自動化程度低、檢查率低的缺陷,.,31,基因芯片的種類,診斷芯片 用于疾病診斷 檢查芯片 用于海關(guān)等處的商品檢疫 表達(dá)譜

18、基因芯片或治療芯片 用于功能基因檢查芯片,.,32,基因芯片的應(yīng)用,基因診斷 藥物篩選 尋找靶基因 基因表達(dá)譜,.,33,DNA指紋鑒定,利用重復(fù)序列中不存在切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶Hinf I酶切整個基因組，形成長短不等的DNA片段，電泳后將其分開，然后用肌紅蛋白基因的第一內(nèi)含子中的串聯(lián)重復(fù)序列作為探針，用32P標(biāo)記探針的核心序列用探針與待測DNA片段進(jìn)行雜交，不同個體所得到的雜交帶不同，通過放射自顯影檢測雜交帶紋，由于不同個體所得到的DNA帶紋不同，這種技術(shù)即DNA指紋圖譜,.,34,DNA指紋鑒定的遺傳基礎(chǔ),基因組中的重復(fù)序列 利用VNTR標(biāo)記,.,35,DNA指紋制備,從人體組織和細(xì)胞核中分

19、離DNA 利用限制性酶切消化DNA 利用凝膠電泳分離DNA片段 使DNA片段變性 通過Southern技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜固定 利用探針與待測DNA雜交 通過放射自顯影進(jìn)行鑒定,.,36,DNA指紋的遺傳特性,沒有突變時(shí)，同一個體不同組織其DNA帶紋相同 即便突變，同一個體不同組織的帶紋差異很小 不同個體帶紋差異較大,.,37,DNA指紋的應(yīng)用,孿生的遺傳鑒定 親子鑒定 身份鑒定,.,38,基因治療的成果,1990年美國國立衛(wèi)生研究院首次報(bào)道用基因治療的遺傳疾病。 患者機(jī)體不能合成胸苷激酶（ADA）而導(dǎo)致先天性免疫缺陷綜合癥。 治療中，將正常ADA基因引入患兒體內(nèi)，產(chǎn)生一定的ADA產(chǎn)物，并檢測到治療前從未產(chǎn)生過的抗體，顯示免疫系統(tǒng)趨于正常。 國內(nèi)20世紀(jì)90