第二章發(fā)酵液預(yù)處理.ppt

1、第二章發(fā)酵液預(yù)處理,微生物經(jīng)過好氣性發(fā)酵可厭氧發(fā)酵培養(yǎng)后，菌體會大量繁殖，并合成和積累了相當(dāng)濃度的代謝產(chǎn)物，這時便終于發(fā)酵，進(jìn)入分離加工過程。 不管是胞內(nèi)產(chǎn)物還是胞外代謝產(chǎn)物，在分離純化目的產(chǎn)物時，首先都要通過發(fā)酵液的預(yù)處理。將固相、液相分離后，才能采用各種物理、化學(xué)、生物的方法進(jìn)行產(chǎn)物的進(jìn)一步分離純化。,發(fā)酵液預(yù)處理是指采用凝集、絮凝、加熱、稀釋法等技術(shù)來加速固相、液相分離。 過濾和離心是其最基本的單元操作。,發(fā)酵液預(yù)處理技術(shù)水平高低、質(zhì)量好壞，對減輕后續(xù)分離純化的負(fù)荷、回收率、產(chǎn)品質(zhì)量和生產(chǎn)成本等均具有重大影響。 其中從發(fā)酵液中進(jìn)行菌體的回收是目前發(fā)酵液預(yù)處理的瓶頸問題之一。,第一節(jié)發(fā)酵液

2、預(yù)處理的方法,發(fā)酵產(chǎn)物在發(fā)酵液中的濃度較低，并與大量可溶的和混懸的雜質(zhì)混雜在一起。 發(fā)酵液黏度大，過濾性能差，所以在過濾前必須進(jìn)行預(yù)處理。,一、發(fā)酵液的一般特征,不同的發(fā)酵過程所用的微生物、原料、培養(yǎng)基種類和發(fā)酵工藝過程各不相同，發(fā)酵液的特性也就各不相同，需根據(jù)不同發(fā)酵液的特性來合理選擇和優(yōu)化發(fā)酵液預(yù)處理的方法及條件。,1、發(fā)酵液組成大部分是水，含水量達(dá)90%99%； 2、發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，有的甚至在1%以下； 3、發(fā)酵液中的懸浮固形物主要是菌體和蛋白的膠狀物，粘度大，不易過濾，增加了后續(xù)的難度。,4、發(fā)酵液中含有培養(yǎng)基中的殘留成分，對后續(xù)提取、精制等操作產(chǎn)生影響； 5、發(fā)酵液中含有少

3、量的代謝副產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)、理化特性與目標(biāo)物極為相似，會對后續(xù)操作有影響； 6、發(fā)酵液中含有色素、毒性物質(zhì)等有機(jī)雜質(zhì)，不僅增加提取過程的困難，還會對產(chǎn)品的質(zhì)量、安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)等產(chǎn)生負(fù)面影響。,二、發(fā)酵液預(yù)處理的目的和要求,發(fā)酵液屬于復(fù)雜的多相體系，產(chǎn)物濃度低，雜質(zhì)組成復(fù)雜。若不經(jīng)預(yù)處理，會使后續(xù)的過濾、離心操作速度過慢或無法進(jìn)行，使發(fā)酵很難實(shí)現(xiàn)規(guī)?；墓I(yè)生產(chǎn)。 例：枯草桿菌的發(fā)酵液 P10,（一）發(fā)酵液預(yù)處理的目的,1、改變發(fā)酵液中固體顆粒的物理性質(zhì)（忙改變表面類型、增大尺寸、提高硬度），加快懸浮液中固體顆粒的沉淀速度。 2、盡可能使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)工序處理的相中（多為液相）。 3、能夠除去部分雜

4、質(zhì)，減少后續(xù)處理的負(fù)荷。,（二）發(fā)酵液預(yù)處理的要求,1、菌體分離 發(fā)酵液中除發(fā)酵產(chǎn)物外，還含有大量的菌體，為方便提取和精制，首先要將菌體與發(fā)酵液分離。 為保證離心和過濾順利進(jìn)行，要正確控制發(fā)酵終點(diǎn)。否則對目標(biāo)物的回收均不利。,2、固體懸浮物的去除 通過過濾處理，將發(fā)酵液中相當(dāng)數(shù)量的固體懸浮雜質(zhì)去除，獲得透光度合格的澄清處理液。,3、蛋白質(zhì)的去除 發(fā)酵液中去除菌體和固體懸浮物后，一些可溶性蛋白質(zhì)仍留在濾液中，需設(shè)法去除。 除去蛋白質(zhì)的濾液要保證在一定的pH 范圍內(nèi)不發(fā)生混濁，否則影響溶媒提取和離子交換提取。,4、重金屬離子的去除 重金屬離子的存在，會影響提取和精制，同時會影響發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量和回收

5、率，故必須除去。 5、色素、熱原質(zhì)、毒性物質(zhì)的去除 針對藥用發(fā)酵產(chǎn)品尤為重要。尤其是針劑。,6、改變發(fā)酵液性質(zhì)，以利于提取和精制后續(xù)工序的操作順利進(jìn)行 當(dāng)發(fā)酵終了時，發(fā)酵產(chǎn)物可能在發(fā)酵液中，也可以在菌體內(nèi)部或兩相同時存在。常采用調(diào)節(jié)pH、酸性或堿性的方法使發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入后續(xù)處理的相中。 例：P11 7、調(diào)整適當(dāng)pH值和溫度 避免引起產(chǎn)物的破壞和損失。,三、發(fā)酵液預(yù)處理的方法,從發(fā)酵液中分離固形物的速度，取決于發(fā)酵液的物理性質(zhì)。不同的發(fā)酵液，其流動特性不同。 細(xì)菌和放線菌的粘度較大；發(fā)酵液菌體自溶，存在核酸、蛋白質(zhì)和其它有機(jī)雜質(zhì)，呈懸浮液，且混濁。會導(dǎo)致過濾速度慢。 常采用絮凝和凝聚的方法，使發(fā)酵

6、液中的固體粒子增大，沉降速度提高；或稀釋、加熱、調(diào)整其它理化因子來降低粘度，以利于過濾。,對后續(xù)提取影響最大的是高價的無機(jī)離子（鈣、鎂、鐵）和雜蛋白，前者會影響離子交換的選擇性，后者會造成離子交換容量降低和萃取分層困難。 根據(jù)雜質(zhì)的種類和性質(zhì)的不同，采用不同的方法除去這些雜質(zhì)。,（一）凝集和絮凝,1、凝集 凝集是指在投加的化學(xué)物質(zhì)作用下，發(fā)酵液中的膠體脫穩(wěn)并使粒子相互凝集成為1mm大小塊狀絮凝體的過程。 凝集劑的作用：粒子表面電荷的簡單中和；消除粒子表面穩(wěn)定的雙電荷層；通過氫鍵或其它復(fù)雜的形式與粒子結(jié)合。最終使膠體粒子的排斥電位降低而發(fā)生聚沉。,2、絮凝 絮凝是指某些高分子絮凝劑能在懸浮粒子之

7、間產(chǎn)生橋梁作用，使膠粒形成粗大絮凝團(tuán)的過程。 絮凝的作用：增大發(fā)酵液中懸浮粒子的體積；提高固液分離速度和濾液質(zhì)量。,（1）絮凝劑 無機(jī)絮凝劑：使膠體的排斥電位降低而發(fā)生沉淀。 有機(jī)絮凝劑：絮凝劑的活性基團(tuán)通過靜電引力強(qiáng)烈的吸附在膠粒表面上，降低膠粒雙電層的排斥電位，在膠粒間產(chǎn)生架橋作用，使其相互連接成塊狀結(jié)構(gòu)而沉淀。 有機(jī)高分子絮凝劑含有離子化基團(tuán)，分子中電荷密度很高，可以中和膠體的電性，起凝聚作用。,細(xì)胞壁表面常帶負(fù)電，一般常用陽離子絮凝劑處理發(fā)酵液?？晌龀龀恋砦铮部筛纳品蛛x后濾液的澄清度，同時可凝固部分可溶性雜蛋白，將濾液總蛋白含量降低，而對目標(biāo)產(chǎn)物的活性無影響。,（2）影響絮凝效果的因

8、素 絮凝劑種類：絮凝劑分子量在，鏈越長，吸附架橋效果越好，但在水中溶解度減小會對絮凝不利，故應(yīng)分子量適當(dāng)?shù)男跄齽?絮凝劑濃度：低濃度時，增大濃度有利于絮凝，但濃度過大同樣會產(chǎn)生反作用；圖2-1 pH值：影響絮凝劑活性基團(tuán)的解離，應(yīng)選擇合適pH值，使絮凝劑解離度最大，作用最好。圖2-2 攪拌和時間：攪拌速度和時間要控制在一個合理范圍。圖2-3,凝集和絮凝是發(fā)酵液預(yù)處理的主要方法，是將化學(xué)藥劑事先加入發(fā)酵液中，通過改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，然后再進(jìn)行下一步分離。 凝集和絮凝能使懸浮顆粒尺寸增加，并會加大顆粒的沉降速度，從而使過濾餅在深層過

9、濾時產(chǎn)生較好的顆粒保留作用。,3、對發(fā)酵液凝聚和絮凝方法的研究 P13-14 對不同的發(fā)酵液，首先應(yīng)根據(jù)發(fā)酵液的性質(zhì)、雜質(zhì)的種類等，采用實(shí)驗(yàn)的方法進(jìn)行絮凝劑和凝集劑的篩選；然后對篩選得到的絮凝劑或凝聚劑，再用實(shí)驗(yàn)的方法分別從絮凝劑或凝聚劑的用量、溫度pH值、攪拌速度、時間等因素，進(jìn)行絮凝或凝集處理?xiàng)l件的優(yōu)化，達(dá)到提高絮凝效果的目的。,（二）加熱法,前題：熱穩(wěn)定性高的發(fā)酵液。 方式：最簡單和廉價的預(yù)處理方法。將發(fā)酵液加熱至所需溫度并保持一定時間。 效果：降低發(fā)酵液黏度，加速聚集作用以除去熱變性雜蛋白，破壞凝膠狀膠體結(jié)構(gòu)，增加濾餅孔隙率，減少發(fā)酵液體積，達(dá)到固液分離的目的。,（三）調(diào)節(jié)pH法,作用

10、：促進(jìn)絮凝和凝聚作用；使存在于胞內(nèi)的發(fā)酵產(chǎn)物轉(zhuǎn)入液相中；使發(fā)酵產(chǎn)物以合適的離子狀態(tài)或游離狀態(tài)存在于發(fā)酵液中，防止其沉淀。 例：去除四環(huán)素中鈣、鎂離子 四環(huán)素能與鈣、鎂形成不溶解的化合物，沉積在菌絲體內(nèi)，用草酸酸化后，能將其轉(zhuǎn)入水相。,（四）加水稀釋法,此法適用于離心沉降分離。對于懸浮固體發(fā)酵液，加水稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，對后續(xù)離心沉降分離速度非常有利。 例P14,（五）加入助濾劑法,作用：避免濾布或生成的濾餅阻塞而影響過濾。 從發(fā)酵液中分離菌體、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)時，懸浮物細(xì)小易受壓，易阻塞或粘住過濾介質(zhì)的細(xì)孔。 加入助濾劑后，能在過濾介質(zhì)和要分離的固形物之間形成一層不可壓縮的多孔且極為細(xì)密的濾層，從而截

11、留懸浮雜質(zhì)。 加入助濾劑后，使形成的濾餅疏松，具有較大孔隙，形成暢通的細(xì)密管道。,助濾劑的使用方法： 過濾器的濾布上預(yù)先涂上一層助濾劑，作為過濾介質(zhì)使用，過濾后與濾布一起除去； 將助濾劑按一定比例混入發(fā)酵液中，一起進(jìn)入過濾器或離心機(jī)，使濾層形成疏松的濾餅，降低可壓縮性，使過濾順暢； 將含助濾劑的發(fā)酵液通過壓縮機(jī)，形成過濾介質(zhì)層，然后再進(jìn)行過濾，可提高濾餅滲透性。,（六）加吸附劑或加鹽法,概念：將吸附劑加入到細(xì)菌發(fā)酵液的懸浮液中，使細(xì)菌細(xì)胞吸附在吸附劑上的方法。 原理：在發(fā)酵液中形成龐大的絮狀物把懸浮液中的懸浮粒子裹住，吸附在其中 例：枯草桿菌發(fā)酵液中加入磷酸二氫鈣或氯化鈣，可與發(fā)酵液形成龐大凝

12、膠。鈣又與菌體自溶放出的核酸類物質(zhì)生成不溶性鹽，會沉淀，從而有助于過濾。,（七）高價態(tài)無機(jī)離子去除的方法,1、鈣離子的去除 鈣的來源：發(fā)酵培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽。 去除方法：酸化劑去除。 例：草酸除鈣離子 生成草酸鈣沉淀，同時沉淀還能促使發(fā)酵液中的雜蛋白質(zhì)凝固，提高過濾速度和濾液質(zhì)量；同時能使四環(huán)素類從菌絲中轉(zhuǎn)入水相。,2、鎂離子的去除 加入磷酸鹽，生成磷酸鎂沉淀。同時還可去除鈣離子與鐵離子。 通常加入的磷酸鹽為三聚磷酸鈉。,3、三價鐵離子的去除 加入黃血鹽，生成普魯氏藍(lán)沉淀而去除鐵離子； 加入堿化劑生成氫氧化鐵沉淀。 同時還能沉淀部分蛋白質(zhì)。,(八)可溶性雜蛋白的去除法,1、等電點(diǎn)沉淀 根據(jù)蛋白質(zhì)的

13、兩性性質(zhì)，在等電點(diǎn)時溶解度最低，易產(chǎn)生沉淀，用酸或堿調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值，使其達(dá)到蛋白等電點(diǎn)而沉淀。 但有些蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時仍有一定的溶解度，還要結(jié)合其它的化學(xué)方法。,2、熱處理法 加熱使蛋白質(zhì)變性，其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水基團(tuán)暴露，溶解度降低易產(chǎn)生沉淀。 在目標(biāo)產(chǎn)物耐熱允許的范圍內(nèi)，采用加熱并保持一定時間，可去除可溶性雜蛋白。 例：去除鏈霉素中雜蛋白 pH值3.0，溫度70,時間0.5h，使黏度降為原來的1/6，過濾速度提高10100倍。,3、吸附法 利用吸附作用分離除去雜蛋白質(zhì)。一般情況下，通過各種物理化學(xué)作用產(chǎn)生的沉淀均可吸附一定量的雜蛋白。 例：在枯草桿菌的堿性蛋白發(fā)酵液中加入氯化鈣和磷酸

14、鹽，會生成磷酸鈣沉淀，此沉淀能吸附雜蛋白，同時還能起助濾劑作用。,（九）色素及其他雜質(zhì)的去除,色素的產(chǎn)生：微生物生長代謝過程中分泌的；培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)直接帶來的。 去除方法 ：離子交換法、活性碳吸附法 用DEAE-纖維素從含酶溶劑中吸附色素物質(zhì)，同時還可除去非活性蛋白。提高純化倍數(shù)。 用強(qiáng)堿性陰離子交換劑對解朊酶的果膠酶溶液脫色，其活性損失較少。,第二節(jié) 發(fā)酵液的過濾,經(jīng)過發(fā)酵預(yù)處理后，即采用不同的方法和設(shè)備進(jìn)行固液分離，得到澄清的發(fā)酵液，為下一步提取做準(zhǔn)備。過濾和離心是目前應(yīng)用的主要方法。 體積較小的細(xì)菌和酵母菌，采用離心分離；細(xì)胞體積較大的絲狀體（霉菌放線菌），采用過濾分離。,一、發(fā)酵液

15、過濾的目的,1、為了獲得含所需產(chǎn)物的細(xì)胞或發(fā)酵液； 2、為了去除發(fā)酵液中的固形雜質(zhì)。,二、影響發(fā)酵液過濾的因素,（一）菌種 菌種決定了發(fā)酵液中各種懸浮粒子的大小和形狀。 真菌、霉菌和蛋白質(zhì)絮凝團(tuán)較粗大，易過濾分離，不做特殊處理，直接過濾。 放線菌、細(xì)菌等體積小，菌絲體交織成網(wǎng)狀，過濾困難，需先處理，凝固蛋白膠體后再選擇適當(dāng)?shù)姆椒ǔァ?（二）發(fā)酵液黏度,影響發(fā)酵液黏度的因素： 1、發(fā)酵條件 2、放罐時間（發(fā)酵終了時間） 3、發(fā)酵染菌 4、發(fā)酵液的pH值、溫度,影響發(fā)酵液黏度的因素： 1、發(fā)酵條件 包括培養(yǎng)基組成、未用完的培養(yǎng)基、消沫劑、發(fā)酵周期等。 2、放罐時間 在菌體自溶前放罐。防止色素及膠

16、狀雜質(zhì)增多，過濾困難。,3、發(fā)酵染菌 發(fā)酵液染菌后黏度增大，不利于過濾。 4、發(fā)酵液的pH值、溫度 影響發(fā)酵液的黏度，影響過濾。,三、發(fā)酵液過濾的方法,（一）過濾 在某一支撐物上放過濾介質(zhì)，注入含固體顆粒的溶液，使液體通過，固體顆粒留下。 1、常規(guī)過濾 料液流動方向與過濾介質(zhì)垂直。通常適于過濾直徑較大的懸浮粒子。如放線菌、霉菌發(fā)酵液。 對細(xì)小菌體或黏度較大的發(fā)酵液，需使用助濾劑。,濾餅,傳統(tǒng)的過濾,2、錯流過濾 料液流動方向與過濾介質(zhì)平等的過濾方式。過濾介質(zhì)為微孔濾膜或超濾膜，適用于懸浮粒子較小的發(fā)酵液。 濾膜易污染，需常清洗。 優(yōu)點(diǎn)：在泵的推動下料液平行于膜面流動，料液流經(jīng)膜面時產(chǎn)生的剪切力

17、把膜面上滯留的顆粒帶走，從而使污染層保持在一個較薄的水平。,（二）離心分離,適用于大規(guī)模分離過程。 過濾式離心主要用于分離晶體和母液；沉降式離心適于分離含固形物較低的發(fā)酵液。 設(shè)備：離心機(jī) 缺點(diǎn)：經(jīng)過濾或離心分離后，雖達(dá)到固液分離，但會使一些具有活性的發(fā)酵產(chǎn)物因機(jī)械破壞而造成損失。,（三）發(fā)酵液不經(jīng)固液分離提取,避免活性物質(zhì)損失，常采用此法。 主要方法為離子交換法和萃取法。 優(yōu)點(diǎn)：有利于提高目標(biāo)產(chǎn)物的回收率。,四、提高過濾性能的方法,降低濾餅比阻力：電解質(zhì)、絮凝劑、凝固劑、助濾劑 降低發(fā)酵液黏度：提高溫度等 降低懸浮液中懸浮固體濃度：盡可能降低培養(yǎng)基配料濃度。 熱處理方法：蛋白質(zhì)等膠體粒子變性

18、。,（一）加入助濾劑,細(xì)小膠體粒子發(fā)酵液中加入固體助濾劑，膠體粒子會吸附于助濾劑上，均勻分布于濾層中，降低了濾餅 的可壓縮性，減小過濾阻力。,助濾劑選擇考濾的因素 1、粒度：顆粒大，過濾速度快，濾液澄清度差。 事先通過試驗(yàn)確定。 2、助濾劑的品種 根據(jù)過濾介質(zhì)選擇助濾劑。粗目濾網(wǎng)過濾時，選擇石棉粉、纖維素可有效防止泄漏。 3、用量 根據(jù)操作方式而選擇不同的助濾劑用量。,（二）填加填充凝固劑,利用凝固劑之間的相互作用或和某些溶解鹽類反應(yīng)生成不溶解的沉淀，此沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲體有塊狀結(jié)構(gòu)。同時，產(chǎn)生的沉淀本身還可做為助濾劑。,（三）加入降解酶,發(fā)酵液中存在不溶性多糖時，可于發(fā)酵液中添加酶

19、制劑，使多糖轉(zhuǎn)化為單糖，來提高過濾速度。 例：用淀粉做培養(yǎng)基。需將淀粉水解成葡萄糖。,五、過濾介質(zhì)的選擇,過濾介質(zhì)除具有過濾作用外，還是濾餅的支撐物。此介質(zhì)應(yīng)用足夠的機(jī)械強(qiáng)度和盡可能小的流動阻力。 選擇過濾介質(zhì)的原則 阻力小，濾液清，價格低，來源豐富，機(jī)械強(qiáng)度高，使用壽命長，耐化學(xué)腐蝕、排渣方便。,過濾介質(zhì)的種類 1、織物介質(zhì) 2、粒狀介質(zhì) 3、多孔固體介質(zhì) 4、微孔纖維素薄膜和金屬薄膜介質(zhì),六、過濾操作條件優(yōu)化,改善懸浮液的物理性質(zhì) 改善設(shè)備結(jié)構(gòu) 對于不同的發(fā)酵過程，發(fā)酵液處理和過濾操作條件優(yōu)化主要集中于預(yù)處理和過濾條件的研究，以及新型的過濾介質(zhì)或過濾方法在實(shí)際應(yīng)用效果的研究。,例：VB12發(fā)酵液絮凝處理的研究 由正交實(shí)驗(yàn)確定影響絮凝的主要因素，制定最佳絮凝條件： 絮凝劑為聚合氯化鋁，加入體積為7%； pH值為6；攪拌速度為140r/min；攪拌時間為45s。同時加入硅藻土助濾劑調(diào)整濾餅效果。,七、過濾設(shè)備,發(fā)酵液過濾設(shè)備分類： 重力式、壓力式、真空式、離心式四種過濾器。常采用板框式壓濾機(jī)、板式壓濾機(jī)、自動板框壓濾機(jī)和真空過濾機(jī)。,過濾設(shè)備的選擇原則： 1、根據(jù)物料的過濾性能，初步確定哪種推動力的過濾設(shè)備； 2、根據(jù)物