第十八章 高效液相色譜法

1、1,儀器分析 黃紅霞,第十八章 高效液相色譜法High Performance Liquid Chromatography,HPLC,HPLC定義： 經(jīng)典液相色譜法為基礎(chǔ)，引入氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù) 高壓輸送流動(dòng)相 高效固定相 高靈敏度檢測器 現(xiàn)代液相色譜分析法 分離分析,優(yōu)點(diǎn)與經(jīng)典液相色譜法相比,顆粒極細(xì)（一般為10m以下）、規(guī)則均勻的固定相，(鍵合相)傳質(zhì)阻抗小，柱效高，分離效率高； 高壓輸液泵輸送流動(dòng)相，流速快，分析速度快； 高靈敏度檢測器，靈敏度大大提高。紫外檢測器最小檢測限可達(dá)109g，而熒光檢測器最小檢測限可達(dá)1012g。,優(yōu)點(diǎn)與氣相色譜法相比,不受試樣的揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制

2、，應(yīng)用范圍廣； 可選用各種溶劑作為流動(dòng)相，對(duì)分離的選擇性有很大作用，選擇性高； 一般在室溫條件下進(jìn)行分離，不需要高柱溫。,第一節(jié)高效液相色譜法的主要類型和原理,一、主要類型 按固定相的聚集狀態(tài)：LSC, LLC 按分離機(jī)制： 分配色譜法 吸附色譜法 離子交換色譜法 空間排阻色譜法,常用的色譜類型 化學(xué)鍵合相色譜法 離子抑制色譜法 離子對(duì)色譜法 其他色譜類型 -親合色譜法 -手性色譜法 -膠束色譜法 -電色譜法,二、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）,以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法，簡稱鍵合相色譜法 化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相,優(yōu)點(diǎn)： 固定相的均一性和穩(wěn)定性好，在使

3、用過程中不易流失，使用周期長； 柱效高；重現(xiàn)性好； 能使用的流動(dòng)相和鍵合相的種類多，分離的選擇性高 正相（normal phase，NP）和反相（reversed phase，RP）鍵合相色譜法： 根據(jù)化學(xué)鍵合相與流動(dòng)相極性的相對(duì)強(qiáng)弱,（一）正相鍵合相色譜法,固定相：極性鍵合相 如氰基（CN）、氨基（NH2）或二羥基鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠） 流動(dòng)相：非/弱極性溶劑加極性調(diào)整劑 如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑） 適用范圍：溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物 如一些在硅膠柱上分離的物質(zhì),正相鍵合相色譜法,分離機(jī)制？ 分配：把有機(jī)鍵合層作為一個(gè)液膜看待，溶質(zhì)在兩相的溶解? 吸附：溶

4、質(zhì)與鍵合極性基團(tuán)間的誘導(dǎo)、氫鍵和定向作用? 保留行為：極性強(qiáng)的組分k大，后洗脫出柱。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，使組分k減小，tR減小。,（二）反相鍵合相色譜法,固定相：非極性鍵合相 如十八烷基硅烷（C18，ODS）、辛烷基（C8）鍵合硅膠 流動(dòng)相：水為基礎(chǔ)溶劑，加入一定量與水混溶的極性調(diào)整劑 常用甲醇水、乙腈水等 應(yīng)用：最廣 非極性至中等極性的組分（還有有機(jī)酸、堿及鹽等）,保留機(jī)制 疏溶劑,溶質(zhì)的保留主要是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。 不是溶質(zhì)分子與鍵合相間的色散力。,反相鍵合相色譜法,保留行為的主要影響因素 1、溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)（極性） 極性

5、越弱，疏水性越強(qiáng)，k越大，tR也越大。 同系物碳數(shù)越多，極性越弱，k越大； 引入極性取代基，降低疏水性，k值變小。 2、固定相 鍵合烷基的疏水性隨碳鏈的延長而增 加，溶質(zhì)的k也增大。 硅膠表面鍵合烷基的濃度越大，則溶 質(zhì)的k越大。,反相鍵合相色譜法,保留行為的主要影響因素 3、流動(dòng)相 極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，使溶質(zhì)的k越大 溶劑種類：水為弱溶劑，醇為強(qiáng)溶劑 溶劑比例：水的比例增加，使k增大 中性鹽的加入：使中性溶質(zhì)的k增大 pH：影響弱酸、弱減的離解 流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小。,離子抑制色譜法（ISC） 用少量弱酸、弱堿或緩沖溶液，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制有機(jī)弱酸、弱堿

6、的離解，增加疏水締合作用，使k變大。 適用于3pKa7的弱酸、7pKa8的弱堿,反相鍵合相色譜法,把離子對(duì)試劑加入到含水流動(dòng)相中，組分離子在流動(dòng)相中與離子對(duì)試劑的反離子生成中性離子對(duì)，增加溶質(zhì)與非極性固定相的作用，使k增加，改善分離效果。,（三）反相離子對(duì)色譜法,反相離子對(duì)色譜法,離子對(duì)模型,3,3,+,+,(,),+,3,s,3,(,+,固定相,+,(,),+,B,),+,流動(dòng)相,通式,影響保留行為的因素 離子對(duì)試劑的種類和濃度：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；在一定范圍內(nèi)試劑的濃度升高，溶質(zhì)的k增大 流動(dòng)相的pH：有利于組分和離子對(duì)試劑離子化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的k值最大 固定相 、流動(dòng)相

7、性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。,適用范圍和離子對(duì)試劑的選擇,適用范圍：有機(jī)酸、堿、鹽，離子型和非離子型化合物的混合物。 分析酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)：用季銨鹽，如四丁基銨磷酸鹽（TBA）和溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）等。 分析堿類或帶正電荷的物質(zhì)：用烷基磺酸鹽或硫酸鹽，如正戊烷基磺酸鈉（PICB5）、正己烷基磺酸鈉（PICB6）。,第二節(jié)高效液相色譜法的固定相和流動(dòng)相及其選擇,固定相應(yīng)符合下列要求： 顆粒細(xì)且均勻； 傳質(zhì)快； 機(jī)械強(qiáng)度高，能耐高壓； 化學(xué)穩(wěn)定性好，不與流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。,一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相,（一）鍵合相的種類 非極性鍵合相 ： 非極性烴基，如C18C8C1與苯基等鍵合

8、在硅膠表面； 用于反相色譜； 長鏈烷基可使溶質(zhì)的k增大，選擇性改善，載樣量提高，穩(wěn)定性更好。,鍵合相的種類 弱極性鍵合相： 醚基和二羥基等鍵合相 用于反相或正相色譜 極性鍵合相： 常用氨基氰基鍵合相（氰乙硅烷Si(CH2)2CN)鍵合硅膠 一般用于正相色譜 特殊用途的鍵合相,（二）鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn),鍵合反應(yīng) 硅氧烷（SiOSiC）型：氯硅烷與硅膠進(jìn)行硅烷化反應(yīng),如：YWGC18H37，無定形硅膠YWG上鍵合了 十八硅烷基；Spherisorb ODS，球形硅膠 Spherisorb 上鍵合了ODS。,鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn),鍵合相的性質(zhì) 含碳量：含碳的百分?jǐn)?shù) 覆蓋度 ：已反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表

9、面硅醇基總數(shù)的比例 封尾（end-capping）：在鍵合反應(yīng)后，用三甲基氯硅烷等進(jìn)行鈍化處理，減少殘余硅醇基。,鍵合相的特點(diǎn) 使用過程中不流失； 化學(xué)穩(wěn)定性好； 適于梯度洗脫； 載樣量大 注意 流動(dòng)相的pH一般應(yīng)在2-8，否則會(huì)引起硅膠溶解；(也有適用寬pH范圍的鍵合相)。,鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn),二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動(dòng)相,對(duì)流動(dòng)相的要求： 與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 對(duì)試樣有適宜的溶解度。使k在110范圍內(nèi)， 與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時(shí)，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。 純度高，粘度小。低粘度流動(dòng)相如甲醇乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。,（一）流動(dòng)相對(duì)分離的影響 n由色譜柱（固定相）性

10、能決定， 主要受溶劑種類的影響， k受溶劑配比的影響。,（二）流動(dòng)相的強(qiáng)度和選擇性 溶劑的極性（強(qiáng)度） 正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng) 反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng) 溶劑的選擇性 不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同 混合溶劑（二元或多元流動(dòng)相）,三、分離條件的選擇,（一）HPLC中的速率理論 渦流擴(kuò)散A=2dp 球形、小粒度、均勻（RSD5%）固定相，勻漿高壓填充，以降低A。 縱向擴(kuò)散B=2Dm 可以忽略。 因?yàn)镈l很小，室溫操作，且U大于U最佳,HPLC中的速率理論,傳質(zhì)阻抗 固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略 ，因df極小; 流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm 要求： dp小，Dm大,靜態(tài)

11、流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗： 由于部分流動(dòng)相在固定相微孔內(nèi)的滯留 靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗系數(shù)Csm Csm dp2， Csm 1/Dm，而DmT/ 要求: 固定相dp2、 流動(dòng)相都小,HPLC中的速率理論,H =A + Cmu + Csmu 原因：化學(xué)鍵合相，液體流動(dòng)相 HPLC的實(shí)驗(yàn)條件應(yīng)該是： 小粒度、均勻的球形化學(xué)鍵合相； 低粘度流動(dòng)相，流速不宜過快； 柱溫適當(dāng)。,HPLC中的速率理論,（二）正相鍵合相色譜法的分離條件,固定相 極性鍵合相如氰基、氨基鍵合相等 流動(dòng)相 烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑,（三）反相鍵合相色譜法的分離條件,固定相非極性鍵合相如ODS 流動(dòng)相以水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、 乙腈等極性調(diào)節(jié)劑 弱

12、酸、弱堿或緩沖鹽作為離子抑制劑 加入0.1%1%的醋酸鹽、磷酸鹽可減少殘余硅醇基的作用,（四）反相離子對(duì)色譜法的分離條件,固定相 盡可能選擇表面覆蓋度高且疏水性強(qiáng)的非極性鍵合相， 離子對(duì)試劑 離子對(duì)試劑所帶的電荷應(yīng)與試樣離子的電荷相反 流動(dòng)相pH使試樣組分與離子對(duì)試劑全部離子化 有機(jī)溶劑及其濃度 同一般HPLC,第三節(jié)高效液相色譜儀,組成 輸液系統(tǒng) 進(jìn)樣系統(tǒng) 色譜柱系統(tǒng) 檢測系統(tǒng) 數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng),一、輸液系統(tǒng),高壓輸液泵 恒流泵：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵 雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。 有串聯(lián)式和并聯(lián)式,輸液泵應(yīng)具備的性能： 流量精度高且穩(wěn)定 流量范圍寬 能在高壓下連續(xù)工作 液

13、缸容積小 密封性能好，耐腐蝕,輸液泵操作注意事項(xiàng)： 防止固體微粒進(jìn)入泵體 流動(dòng)相不應(yīng)含有腐蝕性物質(zhì) 防止溶劑瓶內(nèi)的流動(dòng)相被用完 不超過規(guī)定的最高壓力 流動(dòng)相一般應(yīng)該先脫氣,二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng),進(jìn)樣器 進(jìn)樣閥（六通閥）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置,色譜柱 由柱管和固定相組成 分析柱、制備柱 性能評(píng)價(jià) H、n、fs、k和的重復(fù)性，或R。,三、檢測系統(tǒng),（一）檢測器的主要性能 要求： 靈敏度（sensitivity）高（檢測限低） 噪音（noise）低 線性范圍（linear range）寬 重復(fù)性（repeatability）好 適用范圍廣（通用型、專屬型）,（二）紫外檢測器,檢測原理： 朗伯比爾 (Lambe

14、rt-Beer) 定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比 A=Cl 特點(diǎn)： 靈敏度較高（10-610-9 g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。,局限： 只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。 專屬型、濃度型檢測器,紫外（UV）檢測器,固定波長檢測器 ：254nm 可變波長檢測器： 光源：氘燈（和鎢燈）， 200400（800）nm， 單色器，流通池（試樣），光電管 光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似 光電二極管陣列檢測器 (PDAD)： 一系列光電二極管，一個(gè)二極管對(duì)應(yīng)接受光譜上約1nm譜帶寬的單色光,紫外(UV)檢測器,光電二極管陣列檢測器 工作原理：復(fù)光通過流通池，再進(jìn)入單色器，分光后照射在二極管陣列裝置上，同時(shí)獲得各波長的信號(hào)強(qiáng)度，即獲得組分的吸收光譜。獲得三維光譜色譜圖。 用途：吸收光譜用于組分的定性，色譜峰面積用于定量,判斷峰純度。,紫外檢測器,（三）熒光檢測器(FD),檢測原理： 化合物受紫外光激發(fā)后，發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的光，稱為熒光； 熒光強(qiáng)度 (F) 與激發(fā)光強(qiáng)度 (I0) 及熒光物質(zhì)濃度 (C) 之間的關(guān)系為： F=2.3QKI0Cl Q為量子產(chǎn)率，K為熒光效率，為摩爾吸光系數(shù)，l為光徑長度