遺傳學經(jīng)典課件第15章基因工程導論

1、第十九章 基因工程導論,本章學時數(shù)：3-4學時 本章重點：1.基因工程原理和方法 2.轉基因技術及應用,遺傳工程,廣義的遺傳工程 指的是用遺傳學手段來改造或重組生物的遺傳特性的技術，包括雜交、細胞工程、染色體工程、蛋白質工程和基因工程等。 狹義的遺傳工程 僅指基因工程。,基因工程,Gene engineering 指用類似工程設計的方法，人為地在體外將核酸分子插入質粒、病毒或其他載體中，構成遺傳物質的新組合，并將它轉移到原先沒有這類分子的寄主細胞中擴增和表達。 DNA重組技術是基因工程的基礎。,重組DNA技術,Recombinant DNA technology,1972年，Berg發(fā)明。 定

2、義：指在體外將不同來源的DNA進行剪切和重組，形成嵌合DNA分子，通過載體系統(tǒng)，將之導入宿主細胞，使其擴增表達從而使宿主細胞獲得新的遺傳性狀。 步驟：1. 分離制備目的基因或特定的DNA片段 2. 目的基因與載體連接，構建重組DNA分子 3.重組DNA分子引入宿主并擴增表達。,質粒DNA,提取,酶切,細胞,連接，形成嵌合質粒,在大腸桿菌中擴增,DNA重組技術,基因工程的基本內容和技術,基因工程的核心技術是分子克隆 主要內容： 從復雜生物體基因組中，分離帶有目的基因的DNA片段或用化學方法合成基因。 將目的DNA片段與能夠自我復制并具有選擇標記的載體分子在體外連接，形成重組DNA分子 將重組的D

3、NA分子引入到適宜的受體細胞中進行擴增 從繁殖的大量細胞群體中篩選和鑒定，以獲得重組DNA分子的受體細胞的克隆 從所篩選的受體細胞克隆提取已擴增的目的基因后，或再將其克隆到表達載體上，導入寄主細胞，以便在新的背景下實現(xiàn)功能表達，生產(chǎn)人們所需的物質，或將已擴增的目的基因作進一步的分析研究。,基因工程的基本技術,核酸研究技術 核酸提取技術 核酸鑒定技術 核酸測序技術 核酸人工合成技術等 培養(yǎng)技術 微生物培養(yǎng)技術 動植物細胞培養(yǎng)技術 轉化技術 篩選技術等等,限制性核酸內切酶,限制性內切核酸酶restriction endonuclease，簡稱限制酶restriction enzyme 可識別DNA

4、鏈的特定堿基順序并在特定位置將DNA鏈切斷，形成平切或錯切端口的水解酶。 限制酶的命名規(guī)則： 通常用細菌學名（屬名和種名）、菌株名、特征和發(fā)現(xiàn)的順序縮寫表示。如EcoRI是從含R質粒的大腸桿菌中分離的第一個限制性內切酶。,三類限制酶的主要特性,限制酶的共性：只降解雙鏈DNA分子；各有特定的核苷酸序列識別特異性；酶活性需要鎂離子的激活 根據(jù)結構、切割位點和識別序列間的距離不同和酶激活所需輔助因子的差異等，可以將限制酶分為三類,II型限制酶的基本性質,R=A 或 G Y=C 或 T M=A 或 C K=G 或 T S=C 或 G W=A 或 T H=A 或 C 或 T B=C 或 G 或 T V=

5、A 或 C 或 G D=A 或 G 或 T N=A 或 C 或 G 或 T,修飾酶,修飾酶 內切酶對自身的DNA也有可能的破壞。 修飾酶識別特定的順序并將其甲基化，保護不被限制性內切酶作用。,DNA的限制酶分析和物理圖譜,DNA連接酶,DNA連接酶(ligase)是一種能夠催化DNA中相鄰的3OH和5磷酸基末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA拼接起來的核酸酶。 連接酶催化反應的最適溫度是37。 連接酶把兩個具有粘性末端的DNA分子連接在一起的方式稱作“粘接”，而使平末端的雙鏈DNA分子彼此連接的方式則稱為“端接”。連接酶也用于連接化學合成的銜接物(linker)，這有助于體外合成人造基因。,反

6、轉錄酶,反轉錄酶（reverse transcriptase,RT）是一類很獨特的DNA聚合酶，以RNA為模板來指導DNA的合成。 1970年首先在RNA病毒中發(fā)現(xiàn)，由反轉錄病毒的pol基因編碼。 現(xiàn)在常用的反轉錄酶由和兩條多肽鏈組成， 肽鏈的羧基端具有反轉錄酶活性，而氨基端有RNaseH活性； 肽鏈具有以RNA-DNA雜種分子為底物的53脫氧核酸外切酶活性。,反轉錄酶的應用,以mRNA為模板合成cDNA 克隆基因 制備探針,目的基因的分離或制備,人工合成目的基因 當RNA的堿基順序或蛋白質的氨基酸順序已知時，用特定的儀器進行合成。 目的基因分離 富含G/C對的基因 加熱后用SI核酸酶切除單鏈

7、，離心得到雙鏈片段。 易得到mRNA的基因 用polyT柱分離mRNA，在反轉錄酶作用下合成cDNA，除去RNA，用DNA聚合酶下合成雙鏈。 并非嚴格意義上的基因。 PCR擴增 進化中DNA保守性很強，不同生物同一功能基因的順序大部分相同，設計引物PCR擴增。,目的基因的獲得,PCR擴增獲得目的基因,/sites/entrez?db=Nucleotide,載體 vector,分子克隆的載體應具備的條件： 在細菌中增殖，可以在菌株間傳遞，也可以轉化菌株。 含有酶切位點，最好是對多種限制酶都有單一切點，切點不在復制原點內。 含有抗性基因（具備對重

8、組體容易檢測的選擇性遺傳標記）。 其他 包括質粒、噬菌體和病毒,載體 vector,分類： 克隆載體，以繁殖DNA片段為目的的載體。如pBR322及其衍生質粒。 穿梭載體，既能在真核細胞中復制又能在原核細胞中復制的載體。 表達載體，用于使克隆的外源基因在宿主細胞內表達的載體。需要有強啟動子和終止子；轉錄在誘導時進行，產(chǎn)生的mRNA具有AUG和SD。,構建重組DNA,質粒載體,基本性質 共價閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，大小從1kb到200kb不等，常帶有特殊的基因。 含有復制子，可獨立復制但依賴宿主的酶系 松弛型復制質粒和嚴緊型復制質粒 具有轉移特性，接合型質粒（自主轉移質粒）和非接合型質粒 具有

9、不相容性,質粒載體的構建,早期用天然質粒，有局限性 改造 改變大小 引入適當?shù)倪x擇標記 改變限制酶的切割位置 增加合適的酶切位點,pBR322的結構,4362kb 有HindIII、BamHI、Sal I、Pvu II、Cal I、AvaI和EcoR1單一切點 有Ampr和Tetr基因,pBR322的構建,噬菌體載體,噬菌體是迄今為止研究得最為詳盡的一種大腸桿菌雙鏈DNA噬菌體。它的DNA分子兩端各有由12個核苷酸組成的粘性末端，兩者互補可形成COS位點(cohesiveendsite)。,柯斯質粒載體,柯斯質粒(cosmid)是人工構建的帶有粘性末端cos的一類質粒，其主要組成有質粒的復制起

10、始區(qū)和抗藥標記、一種或多種限制酶的單一切點以及DNA的COS區(qū)小片段(約20至數(shù)百個堿基對)。 因而這類質粒兼具噬菌體和質粒的優(yōu)越性，又具有高容量的克隆能力，容納外源DNA的長度可達45kb左右。,單鏈DNA噬菌體載體,真核基因克隆的載體,植物 用于植物基因轉移的病毒載體 質粒載體 動物 病毒載體 人工染色體,用于植物基因轉移的病毒載體,多種植物病毒經(jīng)過改造后可用作載體。,質粒載體,Ti 和Ri等,動物病毒載體,改造后失去毒性的動物病毒,人工染色體,artificialchromosome 一些真核基因過于龐大不能作為單一片段克隆到噬菌體載體或質粒中 P1噬菌體人工染色體(p1artifici

11、alchromosome，PAC) 細菌人工染色體(bacterialartificialchromosome，BAC) 酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC),酵母人工染色體YAC,以酵母作為構建人工染色體的材料，是由于其基因組很小，約為114mb，且其中極少內含子，沒有重復序列和假基因。其基因行為和表達方式基本上與高等生物類似，如復制、重組、染色體分離等等，因而是研究真核生物分子遺傳學的重要實驗模型。 近年對有關酵母染色體的主要組分：著絲粒、自主復制序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)及端粒的研究又較清楚，并被

12、分離和克隆出來，其功能區(qū)已縮小到數(shù)百堿基對，這些對研究高等生物染色體的結構與功能也是極為有利的。,基因組克隆,用限制性內切酶切割整個基因組DNA，把所得的大量基因組DNA片段與載體連接，然后轉化到細菌中去，讓宿主菌長成克隆。由此而得的克隆中每個細胞的載體上都包含有特定的基因組DNA片段。這樣的一套克隆便稱作基因組克隆，而這些克隆中的一套基因組DNA片段則叫做基因組文庫(genomiclibrary)。,基因組文庫 genome library,將某種生物的基因組DNA用限制性內切酶切割后分別與載體組合構建一系列重組質粒，轉移到細菌中，通過細菌增殖保存基因片段，形成多個基因克隆。 在得到的克隆數(shù)

13、目多到可以把該生物的全部遺傳信息都包含在內時，這些克隆的總體就稱為基因組文庫。,基因文庫,cDNA文庫的構建和應用,cDNA基因文庫(cDNAlibrary)是指以mRNA為模板，在反轉錄酶及其他一系列酶的催化作用下所獲得的雙鏈cDNA，經(jīng)與適當載體連接并轉化到寄主細胞內進行擴增，由此而構成包含著相應基因編碼序列的一群克隆。 與基因組DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其間隔序列早已在拼接過程中被刪除，而由這種成熟mRNA為模板轉變而來的DNA基因，自然也不含有非編碼序列。 cDNA克隆除以mRNA為起始材料這一優(yōu)點外，其構建比較簡易可行，而且由于每一個cDNA克隆都只含有一種mR

14、NA序列，這樣在選擇中出現(xiàn)假陽性的概率也就較低,基因工程技術的應用,基因工程技術的應用,生物合成 基因結構與定位 RFLP 基因治療 環(huán)境治理 分子標記,生物合成,目的基因在細菌中的表達，產(chǎn)生人們需要的蛋白質。 1977，Boyer將編碼人體腦激素的基因轉移到大腸桿菌中，使細菌合成了人體生長激素釋放抑制因子。 發(fā)酵法生產(chǎn)的成本得到大大降低,植物基因工程與農作物育種,動物基因工程與畜禽品種改良,借助基因工程技術把外源目的基因導入生殖細胞、胚胎干細胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體，即轉基因動物(transgenicanimal)。,基因

15、工程技術與醫(yī)學研究,基因治療,1990年，首例基因治療 將有功能的基因插入病毒基因組中，感染體外培養(yǎng)的淋巴細胞，篩選轉基因表達細胞進行擴增，然后注回患者體內，可以保持一段時間的效果，達到目的。,轉基因技術及應用,農桿菌介導法,根癌農桿菌含有致瘤質粒（Ti質粒），在T-DNA區(qū)有反向重復順序，可以與宿主相應區(qū)域發(fā)生重組整合。 步驟： 1.構建重組Ti質粒，導入農桿菌 2.農桿菌與受體植物共培養(yǎng) 3.篩選轉化后代 4.分子檢測,其他轉化方法,植物病毒介導法 種質系統(tǒng)介導法 花粉管通道法 生殖細胞浸泡法 子房注射法 ,其他轉化方法,物理的方法 電激法 基因槍法 超聲波法 激光微束法 顯微注射法 化學

16、的方法 PEG法 脂質體介導法,動物轉基因技術及應用,1.受精卵原核顯微注射法 2.胚胎干細胞介導法 3.反轉錄病毒轉移基因,基因分離新技術,轉座子標簽技術 轉座子插入引起突變，表明插入位點的基因發(fā)生變化。tagging 基因組消減技術 基因敲除技術,分子標記,又稱遺傳標記（genetic marker），指可以追蹤染色體、染色體的某一片段、某個基因或某一特定DNA序列在家系中傳遞軌跡的任何一種遺傳特性。 包括： RFLPs RAPD AFLP SNP VNTR、STS、EST,限制性片段長度多態(tài)性RFLP,Restrict fragment length polymerphism 進化過程中

17、堿基突變導致酶切位點變化，從而產(chǎn)生限制性片段（RF）在長度和多少上的差異，反映了不同個體在DNA上的差異。 RF以共顯性方式遺傳，沒有表型效應，如果知道某種性狀與一定限制性片段連鎖，則可以判斷后代中該性狀的有無。,RFLP,產(chǎn)前診斷,對于某些先天性遺傳疾病，嚴重影響人的生活，可以通過RFLP的產(chǎn)前診斷避免畸形兒或患病兒的出生。 從羊水細胞或絨毛膜細胞提取DNA，進行酶切和電泳、與父母的RFLP進行比較分析，確定。,親子鑒定和犯罪證據(jù),子女獲得來自父母的特異性RFLP，通過比較可以判定子女與成年人（父母）的血緣關系。 RFLP的個體差異性，通過犯罪嫌疑人的DNA與犯罪現(xiàn)場得到的樣品DNA的比較，從