6、 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛.ppt

1、實驗七 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白,一、原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當(dāng)PHPI時，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場中向陽極移動；當(dāng)PHPI時，蛋白質(zhì)為正離子，在電場中向陰極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)，在同一PH值時，因所帶電荷不同，而在電場中的移動速度也不相同，故可用電泳法將其分離。 本試驗以牛血清為材料，醋酸纖維薄膜為支持物，通過點樣、電泳、染色、脫色從而得到血清中蛋白質(zhì)的分離圖譜，再進行觀察和定量分析。 血清中含白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等。其等電點低于pH7.0，在緩沖液中（pH8.6）中，電離成負(fù)離子，在電場中向陽極移動。,二、實驗儀器 1、 牛血清 2、 醋酸纖維薄膜 3、 鑷子

2、 4、 電泳儀 5、 電泳槽 6、 蓋玻片,三、實驗試劑 1、巴比妥巴比妥鈉緩沖液（離子強度，PH8.6）：稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g，溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。用pH計較正后使用。 2、染色液：氨基黑10B0.5g,甲醇50ml，冰乙酸10ml，蒸餾水40ml混勻即可。 3、漂洗液：95%乙醇45ml，冰乙酸5ml和蒸餾水50ml混勻即可。,四、試驗步驟 1、準(zhǔn)備：用鑷子取薄膜一條，浸入緩沖液中，完全浸透后（大約3-5分鐘），用鑷子取出，將無光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，將濾紙對折，吸取多余的緩沖液（注意不要吸的太干）。 2、點樣：取蓋玻片一塊，用玻璃棒將血清均勻的

3、涂在蓋玻片的一端面上，直直的在薄膜一端1/3處點樣。 3、電泳：將薄膜平貼于放在電泳槽上并已浸透緩沖液的濾紙上，無光澤面要向下放置，點樣端放在陰極，進行電泳。電泳條件：電壓90-110V，電流0.4-0.6A,通電60分鐘。 4、染色：電泳完畢，將薄膜浸入染色液（回收）中10分鐘，進行染色。 5、漂洗：染色完畢，將薄膜取出，放入漂洗液中漂洗至背景無色，在浸入蒸餾水中。 6、圖譜觀察：觀察圖譜，將各種血清蛋白質(zhì)按實際比例大小繪于實驗報告紙上。,注意事項,請帶試驗的老師試驗結(jié)束后，將鑷子回收。 醋酸纖維薄膜在光下面能明顯區(qū)分有光澤面和無光澤面。 電泳槽中間為正極，兩端為負(fù)極。 染色液請用完后回收到

4、原來的試劑瓶中。 漂洗薄膜時，請做到“少量多漂”，即用少量的漂洗液去漂洗薄膜，多漂幾次，這樣既不浪費漂洗液，還達(dá)到了漂洗的效果。,實驗十二 維生素C的定量測定（2，6-二氯靛酚滴定法）,一、原理 維生素c又稱為抗壞血酸，其還原型能還原染料2，6-二氯靛酚鈉鹽，本身則氧化成脫氫抗壞血酸。 在酸性溶液中，2，6-二氯靛酚成紅色，被還原后變?yōu)闊o色。 因此可用2，6-二氯靛酚滴定樣品中含有的維生素C，當(dāng)樣品中的維生素C被完全還原后，在滴加過量的2，6-二氯靛酚，溶液變?yōu)榈t色，即為終點。 如無其他雜質(zhì)干擾，則樣品液所還原的2，6-二氯靛酚的量與樣品中所含有維生素C的量成正比。,二、實驗儀器 新鮮水果

5、吸管 容量瓶 滴定裝置 錐形瓶 研缽 漏斗,三、實驗試劑 1、2%草酸溶液：草酸2g，溶于100ml蒸餾水。 2、1%草酸溶液：草酸1g，溶于100ml蒸餾水。 3、標(biāo)準(zhǔn)維生素C液：準(zhǔn)確稱取10.0mg維生素C，溶于1%草酸溶液，并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中，冷藏，最好臨用時配制。此溶液濃度0.1mg/ml. 4、0.1%2，6-二氯靛酚溶液：稱取500mg2，6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氫鈉的熱水中，冷卻，加蒸餾水并稀釋至500ml，濾去不溶物，貯于棕色瓶中，冷藏。,四、實驗步驟,1.樣品中抗壞血酸的提?。?將水果用水洗干凈，用濾紙吸取表面水分。 稱取2.0g，加2%草酸

6、試劑10ml置研缽中研成漿狀。 直接將漿狀物，倒入50ml容量瓶中，用2%草酸溶液稀釋并定容，混勻，靜止10分鐘，過濾（最初數(shù)毫升濾液棄去），濾液備用。,2.滴定 1) 標(biāo)準(zhǔn)液的滴定：準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1.0ml于100ml錐形瓶中，加9ml1%草酸溶液，用2，6-二氯靛酚滴定至淡紅色。滴定終點要保持15秒鐘。有所用2，6-二氯靛酚的體積算出1ml染料相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸。 2) 樣品液的滴定：準(zhǔn)確吸取濾液兩份，每份10ml，分別放入兩個100ml錐形瓶中，滴定方法同上。（ 2，6-二氯靛酚用完后，請回收回原來的試劑瓶中）,五、結(jié)果計算 按下式計算100mg樣品中含抗壞血酸的毫克數(shù)： m=V*T/W*100 V=滴定時所用染料ml數(shù) T=每毫升染料氧化抗壞血酸質(zhì)量 W=10ml樣液相當(dāng)于含樣品