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文檔簡介

1、實驗七 醋酸纖維薄膜電泳法分離牛血清蛋白,一、原理 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。當(dāng)PHPI時,蛋白質(zhì)為負(fù)離子,在電場中向陽極移動;當(dāng)PHPI時,蛋白質(zhì)為正離子,在電場中向陰極移動。血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì),在同一PH值時,因所帶電荷不同,而在電場中的移動速度也不相同,故可用電泳法將其分離。 本試驗以牛血清為材料,醋酸纖維薄膜為支持物,通過點樣、電泳、染色、脫色從而得到血清中蛋白質(zhì)的分離圖譜,再進行觀察和定量分析。 血清中含白蛋白、-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白等。其等電點低于pH7.0,在緩沖液中(pH8.6)中,電離成負(fù)離子,在電場中向陽極移動。,二、實驗儀器 1、 牛血清 2、 醋酸纖維薄膜 3、 鑷子

2、 4、 電泳儀 5、 電泳槽 6、 蓋玻片,三、實驗試劑 1、巴比妥巴比妥鈉緩沖液(離子強度,PH8.6):稱取巴比妥1.66g和巴比妥鈉12.76g,溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。用pH計較正后使用。 2、染色液:氨基黑10B0.5g,甲醇50ml,冰乙酸10ml,蒸餾水40ml混勻即可。 3、漂洗液:95%乙醇45ml,冰乙酸5ml和蒸餾水50ml混勻即可。,四、試驗步驟 1、準(zhǔn)備:用鑷子取薄膜一條,浸入緩沖液中,完全浸透后(大約3-5分鐘),用鑷子取出,將無光澤的一面向上,平放在干凈濾紙上,將濾紙對折,吸取多余的緩沖液(注意不要吸的太干)。 2、點樣:取蓋玻片一塊,用玻璃棒將血清均勻的

3、涂在蓋玻片的一端面上,直直的在薄膜一端1/3處點樣。 3、電泳:將薄膜平貼于放在電泳槽上并已浸透緩沖液的濾紙上,無光澤面要向下放置,點樣端放在陰極,進行電泳。電泳條件:電壓90-110V,電流0.4-0.6A,通電60分鐘。 4、染色:電泳完畢,將薄膜浸入染色液(回收)中10分鐘,進行染色。 5、漂洗:染色完畢,將薄膜取出,放入漂洗液中漂洗至背景無色,在浸入蒸餾水中。 6、圖譜觀察:觀察圖譜,將各種血清蛋白質(zhì)按實際比例大小繪于實驗報告紙上。,注意事項,請帶試驗的老師試驗結(jié)束后,將鑷子回收。 醋酸纖維薄膜在光下面能明顯區(qū)分有光澤面和無光澤面。 電泳槽中間為正極,兩端為負(fù)極。 染色液請用完后回收到

4、原來的試劑瓶中。 漂洗薄膜時,請做到“少量多漂”,即用少量的漂洗液去漂洗薄膜,多漂幾次,這樣既不浪費漂洗液,還達(dá)到了漂洗的效果。,實驗十二 維生素C的定量測定(2,6-二氯靛酚滴定法),一、原理 維生素c又稱為抗壞血酸,其還原型能還原染料2,6-二氯靛酚鈉鹽,本身則氧化成脫氫抗壞血酸。 在酸性溶液中,2,6-二氯靛酚成紅色,被還原后變?yōu)闊o色。 因此可用2,6-二氯靛酚滴定樣品中含有的維生素C,當(dāng)樣品中的維生素C被完全還原后,在滴加過量的2,6-二氯靛酚,溶液變?yōu)榈t色,即為終點。 如無其他雜質(zhì)干擾,則樣品液所還原的2,6-二氯靛酚的量與樣品中所含有維生素C的量成正比。,二、實驗儀器 新鮮水果

5、吸管 容量瓶 滴定裝置 錐形瓶 研缽 漏斗,三、實驗試劑 1、2%草酸溶液:草酸2g,溶于100ml蒸餾水。 2、1%草酸溶液:草酸1g,溶于100ml蒸餾水。 3、標(biāo)準(zhǔn)維生素C液:準(zhǔn)確稱取10.0mg維生素C,溶于1%草酸溶液,并稀釋至100ml,貯于棕色瓶中,冷藏,最好臨用時配制。此溶液濃度0.1mg/ml. 4、0.1%2,6-二氯靛酚溶液:稱取500mg2,6-二氯靛酚溶于300ml含有104mg碳酸氫鈉的熱水中,冷卻,加蒸餾水并稀釋至500ml,濾去不溶物,貯于棕色瓶中,冷藏。,四、實驗步驟,1.樣品中抗壞血酸的提?。?將水果用水洗干凈,用濾紙吸取表面水分。 稱取2.0g,加2%草酸

6、試劑10ml置研缽中研成漿狀。 直接將漿狀物,倒入50ml容量瓶中,用2%草酸溶液稀釋并定容,混勻,靜止10分鐘,過濾(最初數(shù)毫升濾液棄去),濾液備用。,2.滴定 1) 標(biāo)準(zhǔn)液的滴定:準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液1.0ml于100ml錐形瓶中,加9ml1%草酸溶液,用2,6-二氯靛酚滴定至淡紅色。滴定終點要保持15秒鐘。有所用2,6-二氯靛酚的體積算出1ml染料相當(dāng)于多少毫克抗壞血酸。 2) 樣品液的滴定:準(zhǔn)確吸取濾液兩份,每份10ml,分別放入兩個100ml錐形瓶中,滴定方法同上。( 2,6-二氯靛酚用完后,請回收回原來的試劑瓶中),五、結(jié)果計算 按下式計算100mg樣品中含抗壞血酸的毫克數(shù): m=V*T/W*100 V=滴定時所用染料ml數(shù) T=每毫升染料氧化抗壞血酸質(zhì)量 W=10ml樣液相當(dāng)于含樣品

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