PCR技術(shù)及其延伸與應(yīng)用.ppt

1、PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用,聚合酶鏈反應(yīng)或多聚酶鏈反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱無細(xì)胞克隆技術(shù)(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的新方法。 在數(shù)小時內(nèi)可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴(kuò)增107108倍，大大提高了DNA的得率。,PCR技術(shù)最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發(fā)現(xiàn)并研制成功的； 最早的應(yīng)用報道是Saiki等1985年將PCR技術(shù)應(yīng)用于-珠蛋白基因擴(kuò)增和鐮刀狀紅細(xì)胞貧血的產(chǎn)前診斷。 使用1976年Chien等分離的熱穩(wěn)定性T

2、aq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動化成為可能； 1987年Kary Mullis等完成了自動化操作裝置，使PCR技術(shù)進(jìn)行實用階段。,PCR已獲得廣泛應(yīng)用,目前，每年都有上千篇文章發(fā)表。 1991年，期刊“PCR方法與應(yīng)用”（PCR Methods and Application）在美國創(chuàng)刊，使有關(guān)學(xué)者有了自己的論壇和參考的專業(yè)期刊。 Kary Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)獎。(一名加拿大籍英國科學(xué)家Michael Smith因開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮),PCR技術(shù)檢測細(xì)菌,鴨疫里默氏桿菌 霍亂弧菌

3、食源性病原細(xì)菌 結(jié)核桿菌,PCR與病毒類疾病應(yīng)用,雜交法檢測植物病毒和類病毒 利用RT-PCR對黃瓜病毒源種類進(jìn)行檢測 診斷人類乳頭狀病毒HPV感染,診斷遺傳疾病,PCR的特點,特異性高-聚合酶 首次報導(dǎo)用大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入；同時引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的，擴(kuò)增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一,高度敏感： 理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上。 應(yīng)用證實可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上

4、地擴(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA。 能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。,快速 簡便 可擴(kuò)增RNA或cDNA,試劑,引物：決定擴(kuò)增的特異性。根據(jù)檢測的DNA不同，選用不同引物。 耐熱的DNA聚合酶： 10PCR緩沖液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。 dNTP貯備液 DNA模板,操作程序,試劑混合 PCR儀程序設(shè)計：94變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環(huán)30-35次。最后一次循環(huán)結(jié)束

5、后，再將反應(yīng)管置72溫育5min，以確保充分延伸。,PCR反應(yīng)基本條件及其對PCR的影響,模板核酸 有機(jī)溶劑酚 蛋白質(zhì)污染 核酸污染 核酸的量,引 物,引物與PCR的特異性， 引物限定擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。 合成的引物必須經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。 凍干引物于-20至少保存12-24個月，液體狀態(tài)于-20可保存6個月。引物不用時應(yīng)存于-20保存。,緩沖液,緩沖液的目的：給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應(yīng)條件。 目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/LTris-HCl (Tris是一種雙極性離子緩沖液，pH變化于6.8-7.8之間。將Tris濃度加大到50m

6、mol/L，pH8.9,有時會增加產(chǎn)量。 50mmol/L以內(nèi)的KCl，50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應(yīng)液中以NH+4代K+。 反應(yīng)中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%） 5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）有助于酶的穩(wěn)定，尤其在擴(kuò)增長片段（此時延伸時間長）時。,Mg2+,Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性。影響著引物的退火，模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度引物二聚體的形成等。 Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的累積。 Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg

7、2+ 。 DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基團(tuán)均可與Mg2+結(jié)合，降低Mg2+實際濃度。,三磷酸脫氧核苷酸dNTP,dNTP是DNA合成的基本原料。 含量太低，PCR擴(kuò)增產(chǎn)量太少、易出現(xiàn)假陰性。 dNTP濃度過高會導(dǎo)致其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”）。一般認(rèn)為最適的dNTP濃度為50200mol/L。 dNTP的質(zhì)量也直接影響PCR反應(yīng)的成敗。,耐熱DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到廣泛應(yīng)用。 Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩(wěn)定性DNA聚合酶。 Taq DNA聚合酶簡化了PCR程序,

8、增加了PCR特異性及PCR擴(kuò)增效率。該酶的最適溫度很高（79）， 100l反應(yīng)液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳， Taq DNA聚合酶保存不當(dāng)而失活是PCR實驗失敗的常見原因。,溫度循環(huán)參數(shù),變性溫度與時間 復(fù)性溫度與時間 延伸溫度與時間 循環(huán)數(shù)：,PCR實驗中常見問題對策,假陰性問題 假陽性問題。,假陰性,Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制 引物設(shè)計不合理 提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及 PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng) 循環(huán)次數(shù)不夠,假陽性,微量的靶基因污染 標(biāo)本間的交叉污染 樣品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。,PCR

9、技術(shù)的延伸,PCR是一種技術(shù)和方法，在使用中不同的人根據(jù)自己的試驗?zāi)康?、結(jié)合自己的知識背景、研究、創(chuàng)造了不同的PCR方法，開拓了PCR應(yīng)用的新領(lǐng)域?，F(xiàn)在至少有15種不同的PCR用于不同的試驗。,反轉(zhuǎn)錄PCR-Reverse transcription PCR,一種檢測底豐度特異 的方法 互補靶cDNA生成 雙鏈靶DNA 擴(kuò)增靶DNA,RTPCR反應(yīng)體系,PCR的反應(yīng)體系但是模板是RNA RNA酶抑制劑RNasin 反轉(zhuǎn)錄酶 禽酶禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus),Touch down PCR,一般PCR的體系 一般PCR的設(shè)計原理 不同的PCR過程 目的：在不知道理想退火溫度的條件下保證擴(kuò)出產(chǎn)物,梯度PCR,在特殊PCR儀上進(jìn)行的一般PCR 目的：尋找最佳的退火溫度 與TouchDown PCR的區(qū)別 TD PCR：對同一PCR體系采用不同的退火 溫度進(jìn)行 PCR循環(huán) 梯度PCR：同時對多個PCR體系采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR循環(huán),巢（套）式PCR-nested Primer PCR,不同的PCR體系兩對引物 不同的PCR過程兩段循環(huán) 目的：增加