第十八章基因診斷與基因治療.ppt

1、第十八章 基因診斷與基因治療 (gene diagnosis and therapy),2,本章主要內容,基因診斷 基因治療,3,一. 基因診斷概念 利用分子生物學方法，直接檢測基因結構及其表達水平是否異常，從而對疾病作出診斷,為治療提供依據。,第一節(jié) 基 因 診 斷,4,二. 基因診斷特點： 針對性強，特異性高 檢測靈敏度和精確性高 實用性強，診斷范圍廣,5,三. 基因診斷常用技術方法,核酸分子雜交技術 聚合酶鏈反應（PCR）技術 生物芯片 基因測序,6,（一）核酸分子雜交技術 核酸分子雜交 是指一條單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過堿基互補與另一條單鏈核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈的過程。 基本原理

2、： 堿基互補、變性和復性 DNA與DNA雜交： A=T、 GC ; DNA與RNA雜交: A=U、 GC ; 變性： 升高溫度至94左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈； 復性： 緩慢降低溫度（ 52左右），變性的兩條單鏈重新形成互 補雙鏈。,堿基互補,7,hybridization,DNA:DNA 5 A T G C C G A T 3 T A C G G C DNA:RNA 5 A T G C G T A 3 U A C G C A U RNA:RNA 5 A U G C U A C G 3 U A C G A U G C,8,利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核

3、酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在。 核酸探針 是指帶有標記的、并已知堿基序列的DNA或RNA片段，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結合，進而檢測同源序列。 探針標記物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類。,9,1.核酸分子雜交的分類 液相雜交 待測核酸樣本與特異性探針同時溶于雜交液中進行雜交反應； 固相雜交 待測核酸樣本先結合到固相支持物上，再與溶液中的特異性探針進行雜交反應。 常用固相雜交支持物： 硝酸纖維素膜、尼龍膜等,10,2.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序,制備待測核酸樣品,分離、變性、轉移、固化DNA片段

4、,雜交,加入標記核酸探針,檢測雜交信號,標記核酸探針,預雜交,制備核酸探針,漂洗去除未參與雜交的標記探針,11,3. 常用固相核酸雜交方法 Southern 印跡雜交法（Southern blotting ） Northern 印跡雜交法（Northern blotting ） 斑點雜交或狹縫雜交法（Spot/ Slot blot hybridization） 菌落雜交（colony hybridization） 夾心雜交法（sandwich hybridization） 原位雜交（ hybridization in situ）,12,(1) Southern 印跡雜交法,限制性內切酶酶切 檢

5、測雜交信號 提取DNA,Southern 法可用于檢測特異的DNA序列片段,進行基因定位、分子量測定等。,13,（2）Northern 印跡雜交法 （其基本過程類似于上述Southern法） 提取RNA樣本RNA變性瓊脂糖凝膠電泳分離轉移至膜探針（標記DNA或RNA）與之雜交顯影或顯色檢測信號。 Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA,14,（3）斑點雜交或狹縫雜交法 基本過程： 將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上用標記探針與之雜交自顯影或顯色反應檢測雜交信號分析結果。 優(yōu)點： 簡便、快速、靈敏、樣本用量少； 缺點： 特異性不高，有一定比例的假陽性。 用途： 檢測樣

6、本中存在的微量DNA或RNA,15,（4）菌落雜交 該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。,16,（5）夾心雜交法,片斷A 檢測探針 本法優(yōu)點： 特異性強，對樣本純度要求不高，定量較準確。,17,（6）原位雜交 將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而 檢測特異的DNA或RNA序列。 細胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNA-DNA RNA-DNA 三類雜交 RNA-RNA 該法優(yōu)點： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。,有,18,（二）聚合酶鏈反應（PCR）技術,PCR是利用體內DNA復制的原理和DNA變性與復性的性質

7、，在體外對目的基因DNA進行大量擴增的技術。 1. PCR基本原理： PCR技術在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buf.等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經過DNA變性、引物與模板結合（復性）和延伸3個步驟的反復循環(huán) （2530次）過程，使目的DNA呈指數擴增 。,19,PCR技術原理示意圖,（ 94左右）,（52左右）,（72左右）,20,（1）DNA模板的熱變性 將待擴增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應體系中作為模板。 （2）模板與引物的結合（退火或復性） 將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的

8、引物與模板DNA兩端（3端）堿基序列互補結合。,21,（3）引物延伸 將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP 按堿基互補原則連接在DNA引物3端，使鏈延伸， 形成兩條與模板互補的新鏈。 以上為1次PCR循環(huán)（變性、復性和延伸） （新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板） 按照上述（變性、復性和延伸）3個步驟反復循環(huán) ，PCR產物呈指數擴增。 模板DNA 擴增倍數T=2n (n: 循環(huán)次數)。,22,2. PCR各要素及其作用 （1） 模板 PCR模板可以是DNA或RNA。 以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個拷貝； RNA作為模板時，需要： RNA cDNA PCR, 稱

9、此為RT-PCR. （2）耐熱DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 是從耐熱細菌體內提取的一種DNA聚合酶，可在95穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在94變性 52退火72延伸循環(huán)30次過程中不變性失活。,逆轉錄,23,（3）引物 引物是根據已知序列的模板DNA待擴增區(qū)兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。 引物是保證PCR擴增產物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。 引物設計原則如下：,24,引物設計應符合以下基本原則： 長度適宜，一般為1530個堿基； G+C含量，一般為4060； 4種堿基應隨機性分布； 引物自身不應存在互補序列； 兩個引物之間不

10、應有多于4個堿基的互補； 引物3端不應有任何修飾； 引物5可以修飾。,25,（4）緩沖溶液與Mg2+ PCR技術常用1050mmol/L Tris-HCl、Ph8.38.88、偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度； （5）dNTP濃度 PCR一般用50200mol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；,26,（6）參數 變性溫度與時間 一般選擇： 940C， 30秒 退火溫度與時間 取決于引物長度、濃度 和G+C含量， 一般選擇： Tm - 5 延伸溫度與時間 一般選擇： 70 75 循環(huán)次數 取決于模板濃度， 一般循環(huán)：30次,27,PCR操作 各種PCR反應的操作基本相同，只是根據

11、引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環(huán)參數。 將PCR反應管置于DNA自動化熱循環(huán)儀上，輸入各種循環(huán)參數，使DNA擴增在熱循環(huán)儀上很方便地完成。 PCR技術優(yōu)點 特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。 PCR缺點 由于高靈敏度，使易出現假陰性或假陽性結果。,28,3. PCR產物分析 （1）凝膠電泳分析法 可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產物的大小。 同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結果并拍照。 （在待檢靶序列拷貝數多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿

12、足檢測要求。）,29,（2）點雜交分析法 該法有2種： 將擴增產物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進行雜交； 將不同的探針固定在膜上，再用有標記的PCR產物 與之雜交。 本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分析。 (當擴增產物時多條帶時，用此法更合適。),30,(三)基因芯片 將大量序列已知的基因片段以微陣列方式固定在一芯片上做成高密度的點陣排列，與標記樣品進行雜交，然后用計算機分析雜交信號。,31,(四) 基因測序 即，DNA堿基序列分析，這是最確切、最直接的基因診斷方法。 目前常用的方法為Maxam-Gilbert建立的化學裂解法和Sang

13、er建立的雙脫氧末端終止法。,32,四. 基因診斷的臨床應用,(一) 遺傳病的基因診斷 (二) 腫瘤的基因診斷 (三) 感染性疾病的基因診斷,33,舉例： 鐮刀狀紅細胞貧血 珠蛋白基因的第六個密碼子AT 表達產物：谷氨酸纈氨酸 一個堿基突變缺失1個Mst內切酶位點 正常人： 1.1kb 患者： 1.3kb,34,5,3,5,3,1.1 kb,1.3kb,Mst II酶切位點（CCTNATG）,正?；?突變基因,1.3kb,1.1kb,0.2kb,1,2,3,1、正常人 2、突變攜帶者 3、患者,35,第二節(jié) 基因治療 基因治療的概念 基因治療的總體策略 基因治療的基本程序 基因治療的現狀與展

14、望,36,一、基因治療概念 狹義概念 用具有正常功能的基因去置換或增補患者體內有缺陷的基因，從而達到治療疾病的目的。 廣義概念 將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發(fā)揮作用，最終達到治療疾病的目的。,37,二、基因治療的總體策略 基因矯正 基因置換 基因增補 基因失活 “自殺基因”的應用 免疫基因治療 耐藥基因治療,38,（一）基因矯正（gene correction） 對于致病基因中的異常堿基進行精確修復，使其恢復正常功能。 （二）基因置換(gene replacement) 用正常基因在原位替換致病基因，使細胞DNA完全恢復正常狀態(tài)。,39,（三）基因增補*(gene augment

15、ation) 將正?；驅牖颊唧w細胞內，使其整合到染色體中一起表達，以補償缺陷基因的功能 （但致病基因未去除）。 （四）基因失活(gene inactivation) 指將特定的反義核酸導入細胞，通過堿基互補作用與mRNA結合，阻斷腫瘤細胞中基因的異常表達，以抗腫瘤、抗病毒。 反義RNA: 干擾mRNA的互補RNA; 反義DNA: 干擾DNA的互補DNA.,40,（五）“自殺基因”的應用 自殺基因(suicide gene) 這種基因導入受體細胞后可產生一種酶，它可將原無細胞 毒性或低毒藥物前體轉化為細胞毒物質，將細胞自身殺死，這種 基因被稱為“自殺基因”。 如果將自殺基因導入腫瘤細胞，則可

16、將腫瘤細胞殺死。 但對正常細胞則無傷害作用。,41,（六）免疫基因治療 將某些細胞因子（IL-2、GM-CSF等）基因導入腫瘤患者體內，以增強患者的抵抗力。 （七）耐藥基因治療 在腫瘤化療過程中， 把產生抗藥物毒性的基因導入患者體內，從而使患者能耐受更大劑量的化療。,42,三、 基因治療的基本程序 （一）治療性基因的獲得 在了解疾病發(fā)生的分子機制基礎上， 選擇對疾病有治療作用的特定基因。 如，對單基因缺陷遺傳病，可用野生型（非突變）基因即可用于治療； 對于腫瘤，最好選擇某些與該類腫瘤密切相關的癌基因或抑癌基因用于基因治療。 治療性基因獲得的方法很多： 用酶切或探針雜交法從基因組DNA文庫獲得，

17、從cDNA文庫獲取，PCR擴增，人工合成等。,43,（二）基因載體的選擇 基因治療關鍵步驟之一，是將治療基因高效轉移 入患者體內、并能調控其適度表達。 常用的載體有兩類：病毒載體和非病毒載體。 病毒載體：逆轉錄病毒載體， 腺病毒載體， 腺相關病毒載體等； 非病毒載體： 與病毒載體的主要區(qū)別在于：采用理化方法將治療基因轉移入患者體內。,44,（三）靶細胞的選擇 基因治療的受體細胞有生殖細胞和體細胞兩大類。 對生殖細胞進行基因治療，可使該生殖細胞分化發(fā)育成長的個體及其后代均具有正?；?，理論上講是根治遺傳病的理想方法。 但由于涉及安全性和倫理學問題，目前基因治療中禁止使用生殖細胞作為靶細胞，只限于

18、使用體細胞。,45,人類基因治療中，將治療基因導入靶細胞有兩種 途徑。 一種為直接體內療法（in vivo）： 即，將治療基因直接導入體內有關組織細胞； 另一種為間接體內療法（ex vivo）： 即，在體外先將治療基因導入培養(yǎng)的靶細胞內，再將已獲得表達外源基因的遺傳修飾細胞回輸入病人體內，達到治療目的。,46,治療基因 導入受體細 胞的方法,化學方法 物理方法 膜融合法 病毒載體法 質粒DNA直接轉移法,（四）基因轉移方法,磷酸鈣法 DEAE葡聚糖法,電穿孔法 粒子轟擊法（基因槍法）,47,( 五 ) 轉導細胞的選擇鑒定 標記基因技術 基因缺陷型受體細胞技術 基因共轉染技術 分子雜交技術 外源

19、基因表達鑒定 ( 六 ) 回輸體內 將治療性基因修飾的細胞以不同方式回輸體內。,48,四、基因治療的應用與展望 (一)基因治療應滿足的條件： 1、單基因缺陷疾病 2、僅限體細胞的基因治療 3、靶細胞易獲取、培養(yǎng)、及回輸體內。 4、治療效果應勝過對病人的危害。 5、表達水平無需調控且無副作用。 6、需經動物實驗驗證安全可行。,49,（二）基因治療有待解決的問題 1、難以獲得真正有治療作用的基因。 2、外源基因的表達難以在體內精確調控。 3、體細胞經體外培養(yǎng)后，其生物學特性會有 改變。 4、過多的外源蛋白對機體帶來可能的影響。 5、隨機整合潛在的威脅。,50,基因診斷與基因治療（課堂練習） 1.

20、核酸分子雜交主要內容有 制備核酸樣本 B. 制備與標記特異探針 C. 核酸樣本的分離、變性、轉移和固定 預雜交、雜交和漂洗 E. 檢測雜交信號 下列是常用核酸雜交方法的用途，錯誤的是 Southern 印跡雜交法可用于檢測特異RNA序列片斷 Southern 印跡雜交法可用于檢測特異DNA序列片斷 Northern印跡雜交法可用于檢測DNA或RNA Northern印跡雜交法可用于檢測RNA 原位雜交法可用于檢測組織細胞中的DNA或RNA,51,3. 以下是關于PCR技術的敘述，錯誤是 PCR技術進行體外DNA擴增，其過程不同于體內DNA復制過程 需要目的DNA兩條鏈為模板 需Taq 酶代替D

21、NA聚合酶 需RNA引物代替DNA引物 PCR經過DNA變性、復性和延伸3個步驟的反復循環(huán) 基因診斷常用技術有 核酸分子雜交 B. 聚合酶鏈反應 基因芯片 D. 基因測序 E. 以上都可以,52,53,Eggs are coaxed to mature in a culture dish. Each has a remnant egg cell called the polar body and cumulus cells from the ovary clinging to it.,54,While an egg is held still with a pipette, a needle

22、is used to drill through the zona pellucida, removing a plug.,55,After ejecting the zona plug, the needle is inserted back in the egg through the hole to withdraw and discard the polar body and the eggs genetic material.,56,A cumulus cell from another egg is taken up into the needle. Cells called fibroblasts (or their nuclei) can also be used in t