第六章 微生物的生長(zhǎng)繁殖及其控制.ppt

1、第六章微生物的生長(zhǎng)繁殖及其控制、生物個(gè)體物質(zhì)規(guī)律、不可逆地增加，導(dǎo)致個(gè)體體積擴(kuò)大的生物學(xué)過(guò)程。 生長(zhǎng)：生物個(gè)體生長(zhǎng)到某個(gè)階段，以特定的方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)的增加的生物學(xué)過(guò)程。 繁殖：生長(zhǎng)是階段性發(fā)生的量化過(guò)程，繁殖是產(chǎn)生新生命個(gè)體的質(zhì)的變化過(guò)程。 在高等生物中這兩個(gè)過(guò)程是明顯分開(kāi)的，但在下等，特別是單細(xì)胞生物中，由于細(xì)胞較小，這兩個(gè)過(guò)程是密切相關(guān)而難以分開(kāi)的過(guò)程。 吸收、代謝營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、適當(dāng)?shù)耐饨鐥l件、微生物細(xì)胞、 同化作用的速度超過(guò)異化作用后，個(gè)體原形質(zhì)的總量(重量、體積、大小)增加，各細(xì)胞成分以適當(dāng)?shù)谋壤黾雍?，在一定程度上繁殖，引起個(gè)體數(shù)的增加。 客觀地反映了微生物的生長(zhǎng)

2、規(guī)律，用于評(píng)價(jià)群體內(nèi)各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)、群體的生長(zhǎng)、不同抗菌物質(zhì)對(duì)微生物的抑制(或滅絕)作用的效果。 評(píng)價(jià)培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響的微生物生長(zhǎng)，第一節(jié)微生物生長(zhǎng)的測(cè)定，微生物生長(zhǎng)：每單位時(shí)間的微生物數(shù)和生物量的變化，微生物生長(zhǎng)測(cè)定方法，個(gè)體訂正數(shù)法，重量法，比濁法，生理指標(biāo)法，通常是細(xì)菌， 用于測(cè)定酵母菌等單細(xì)胞微生物的生長(zhǎng)狀況和樣品中微生物個(gè)體的數(shù)量(細(xì)菌、孢子、酵母菌)、1、培養(yǎng)平板修正數(shù)法，原理：各活細(xì)菌可在合適的培養(yǎng)基和良好的生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)形成菌落。 采用培養(yǎng)平板修正數(shù)法要求操作熟練、準(zhǔn)確，否則無(wú)法得到準(zhǔn)確的結(jié)果：樣品充分混合，各移液管和涂布棒只能接觸一種稀釋度的菌液，

3、同一稀釋度重復(fù)3個(gè)以上，取平均值的各平板上的菌落數(shù)適當(dāng)，準(zhǔn)確的修正數(shù)容易， 由于一個(gè)菌落可能是由多個(gè)細(xì)胞一起形成的，所以在科學(xué)研究中，一般不用細(xì)胞數(shù)，而用菌落形成單位(colony forming units，CFU )來(lái)表示。 在超濾培養(yǎng)法中，樣品中菌數(shù)低時(shí)，可以使一定體積的湖水、海水、飲用水等樣品通過(guò)超濾器，然后將膜轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)形成的菌落進(jìn)行修訂。 液體稀釋法，主要適用于只能液體培養(yǎng)的微生物，以及使用液體鑒別培養(yǎng)基直接鑒定修訂數(shù)的微生物。 將未知樣品稀釋10倍，然后估計(jì)3個(gè)連續(xù)稀釋度平行接種的多根試管，統(tǒng)一這些平行試管的微生物生長(zhǎng)狀況，長(zhǎng)菌為陽(yáng)性，未長(zhǎng)菌為陰性，根據(jù)數(shù)學(xué)

4、統(tǒng)一計(jì)算樣品中的微生物數(shù)量。 1 .使用血細(xì)胞校正板法、血細(xì)胞校正板，在顯微鏡下校正一定容積的樣品中的微生物的數(shù)量。 缺點(diǎn)：不適合對(duì)死菌和活菌進(jìn)行鑒別的運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的校正數(shù)，需要較高的細(xì)菌濃度，個(gè)體小細(xì)菌很難用顯微鏡觀察，4，顯微鏡直接校正數(shù)法，、2 )其他方法：粒子濃度已知的樣品(例如血液)和被測(cè)定細(xì)胞的細(xì)胞濃度的樣品混合，用顯微鏡下比例修正數(shù)：過(guò)濾修正數(shù)：樣品中菌數(shù)低時(shí)，一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品可以通過(guò)膜過(guò)濾器。然后，對(duì)濾膜進(jìn)行干燥、染色，處理使膜透明，在顯微鏡下校正膜上(或一定面積中)的細(xì)菌數(shù)，生菌計(jì)數(shù)：也可以使用特定的染色技術(shù)，分別計(jì)數(shù)生菌和死菌，以生物量為指標(biāo)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)用

5、一定波長(zhǎng)測(cè)定菌懸濁液的光密度，在實(shí)驗(yàn)測(cè)定時(shí)使菌濃度控制在與光密度成正比的線性范圍內(nèi)。 不那樣做的話是不正確的。 在干重、濕重下直接測(cè)定微生物群的生物量。 通過(guò)測(cè)定試樣中蛋白質(zhì)、核酸含量間接推定微生物群的生物量，測(cè)定多細(xì)胞及絲狀真菌的生長(zhǎng)狀況的有效方法有、3、生理指標(biāo)法、微生物的生理指標(biāo)，例如呼吸強(qiáng)度、耗氧量、酶活性、生物熱等與該集團(tuán)的規(guī)模正相關(guān)。 樣品中的微生物數(shù)量越多，或者生長(zhǎng)旺盛，這些指標(biāo)越明確，就越能夠通過(guò)特定的儀器，例如鐘形呼吸器、微量熱量校正等設(shè)備來(lái)測(cè)量相應(yīng)的指標(biāo)。 常用于微生物的快速鑒定和檢測(cè)，、第二節(jié)細(xì)菌的集體生長(zhǎng)繁殖，微生物的特征：個(gè)體微小、肉眼可見(jiàn)或接觸的微生物是由數(shù)千萬(wàn)個(gè)單

6、一微生物組成的集體。 微生物接種為群體接種，接種后生長(zhǎng)為微生物群體繁殖生長(zhǎng)。 了解細(xì)菌群體的生長(zhǎng)規(guī)律是研究和利用它們的基礎(chǔ)，、一、生長(zhǎng)曲線，生長(zhǎng)曲線(Growth Curve ) :細(xì)菌在定量液體培養(yǎng)基中接種，定時(shí)對(duì)細(xì)胞數(shù)進(jìn)行采樣測(cè)定的微生物學(xué)中提到的“生長(zhǎng)”都是指群體生長(zhǎng)。 生長(zhǎng)曲線通常以細(xì)菌數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸繪制，、生長(zhǎng)曲線，典型的生長(zhǎng)曲線至少可以分為延遲、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期() 生長(zhǎng)0速率(-)總菌數(shù)Lg細(xì)胞數(shù)生菌數(shù)I II III IV培養(yǎng)時(shí)間(h ) (I .延遲II .指數(shù)期III .穩(wěn)定期IV分裂慢，代謝活躍，細(xì)胞形態(tài)變大或生長(zhǎng)，如巨大芽胞桿菌，在慢期末，細(xì)胞平均長(zhǎng)度為剛接種后的6倍。

7、一般處于較晚期的細(xì)菌細(xì)胞體積最大的細(xì)胞內(nèi)RNA，特別是rRNA含量增高，合成代謝活躍，核糖體、酶類和ATP合成加快，易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶。 對(duì)外界的惡劣條件敏感地作出反應(yīng)。 細(xì)胞在活躍地成長(zhǎng)，分裂延遲在這個(gè)階段的后期少數(shù)的細(xì)胞開(kāi)始分裂，曲線稍微上升。 例如：、遲期的出現(xiàn)的原因：微生物接種新的環(huán)境，暫時(shí)分解底物催化酶不足，或者缺乏足夠的中間代謝產(chǎn)物等。 為了產(chǎn)生誘導(dǎo)酶或合成中間代謝產(chǎn)物，需要適應(yīng)期。 調(diào)整代謝，延遲的長(zhǎng)度與菌種的遺傳性、菌齡及移種前后的環(huán)境條件等因素有關(guān)，短的只需幾分鐘，長(zhǎng)的只需幾小時(shí)。 在生產(chǎn)實(shí)踐中縮短延遲的常用手段： (1)根據(jù)遺傳學(xué)方法改變種的遺傳特性，縮短延遲；(2)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期

8、的細(xì)胞作為種子利用；(3)盡量使接種前后使用的培養(yǎng)基組成不存在大的差異。 (4)適當(dāng)擴(kuò)大接種量，指數(shù)期特征： a增長(zhǎng)速度最大，世代最短。 b細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)的c酶系活躍，代謝旺盛。影響、微生物增代時(shí)間(代時(shí))的因素：1 )菌種、微生物及微生物不同菌株的代時(shí)不同，2 )營(yíng)養(yǎng)成分在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的時(shí)期短，3 )營(yíng)養(yǎng)物濃度，在一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速度與營(yíng)養(yǎng)物濃度成正比，在低濃度范圍內(nèi)，影響生長(zhǎng)速度4 )在溫度、一定范圍內(nèi)，生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)溫度呈正相關(guān)。 穩(wěn)定期的特征： a生長(zhǎng)速率常數(shù)等于零，細(xì)胞處于正生長(zhǎng)與負(fù)生長(zhǎng)相等的動(dòng)態(tài)平衡。 b菌體的產(chǎn)量達(dá)到峰值，、穩(wěn)定生長(zhǎng)期(Stationary pHase

9、 ) :營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝產(chǎn)物積累和ph等環(huán)境變化導(dǎo)致細(xì)菌不適合生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度降低到零(即生長(zhǎng)速度降低)。 細(xì)胞重要的分化調(diào)節(jié)階段儲(chǔ)藏糖原等細(xì)胞質(zhì)內(nèi)包物，芽孢桿菌在該階段形成芽孢或形成自然接受狀態(tài)。 也是發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)物積累的重要階段，某些放線菌抗生素的大量形成也處于這個(gè)時(shí)期。 生產(chǎn)上通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(輔料)、提取代謝產(chǎn)物、調(diào)節(jié)pH、調(diào)節(jié)溫度、增加好氧菌通氣、攪拌、振動(dòng)等措施延長(zhǎng)穩(wěn)定生長(zhǎng)期，獲得更多菌體物質(zhì)、積累更多代謝產(chǎn)物。、衰退期(Decline或Death phase ) :營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的枯竭和有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)菌的死亡速度超過(guò)新生速度，整個(gè)集團(tuán)顯示負(fù)增長(zhǎng)。 在這個(gè)時(shí)期死亡的細(xì)菌對(duì)

10、數(shù)增加，但在衰退期的后期，一部分細(xì)菌產(chǎn)生抵抗性，細(xì)菌的死亡速度也降低，存在一部分活菌。 不同的微生物或同一微生物對(duì)不同物質(zhì)的利用能力不同。 有些可以直接利用(例如葡萄糖或NH 4等)。 為了得到利用能力(乳糖和NO3-等)，也有必要經(jīng)過(guò)一定的適應(yīng)期。 前者通常被稱為速效碳源(或氮?dú)庠?，后者被稱為遲效碳源(或氮?dú)庠?。 培養(yǎng)基中同時(shí)含有這兩種碳源(或氮源)時(shí)，微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)形成二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。 培養(yǎng)方法：使群體中的細(xì)胞比較一致，使生長(zhǎng)發(fā)育全部處于同一階段，即多個(gè)細(xì)胞可以同時(shí)生長(zhǎng)或分裂。 同步培養(yǎng)法可使集體細(xì)胞處于同一生長(zhǎng)階段，同時(shí)進(jìn)行分裂生長(zhǎng)。 同步生長(zhǎng)：由同步培養(yǎng)法得到的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞

11、或同步培養(yǎng)物、同步培養(yǎng)：同步培養(yǎng)物常被用作單一細(xì)胞難以研究的生理和遺傳特性及工業(yè)發(fā)酵的種子，是理想的材料。 機(jī)械方法、離心法過(guò)濾分離法硝酸纖維素過(guò)濾法、環(huán)境條件控制技術(shù)(誘導(dǎo)法)、溫度培養(yǎng)基成分控制其他(例如光和暗的交替培養(yǎng))、同步培養(yǎng)、硝酸纖維素過(guò)濾法是最典型的，a .使菌液通過(guò)硝酸纖維素薄膜， 因?yàn)榧?xì)菌和過(guò)濾膜帶有不同的電荷，所以在不同的生長(zhǎng)階段，反轉(zhuǎn)可以在過(guò)濾膜上附著細(xì)菌的b膜，用新鮮的培養(yǎng)液過(guò)濾培養(yǎng)的c膜上附著的細(xì)菌分裂，分裂的子細(xì)胞不與膜直接接觸，除菌體自身的重量外，根據(jù)附著的培養(yǎng)液的重量落入捕集器內(nèi)的d .陷阱在短時(shí)間內(nèi)收集的細(xì)菌處于同一分裂階段，通過(guò)用該細(xì)菌接種培養(yǎng)，可以得到同時(shí)

12、培養(yǎng)物。 機(jī)械法同步培養(yǎng)物可在不影響細(xì)菌代謝的情況下獲得，菌體的生命活動(dòng)必然正常。 但是，該方法存在局限性，部分微生物在同一發(fā)育階段個(gè)體大小不一，甚至差異較大。 這樣的微生物不應(yīng)該采用這樣的方法。 誘導(dǎo)同期增長(zhǎng)的環(huán)境條件多種多樣。任何誘導(dǎo)因子都不影響微生物的生長(zhǎng)，但必須具有特異性抑制細(xì)胞分裂，消除(或消除)這種抑制條件，微生物就會(huì)同時(shí)分裂的特性。 也可以添加培養(yǎng)基中的抑制蛋白質(zhì)合成的物質(zhì)(例如氯霉素)和抑制DNA合成的物質(zhì)(例如5-氟脫氧尿苷)，誘導(dǎo)一定時(shí)間后轉(zhuǎn)移到其他完全培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。 或者用紫外線處理； 芽孢桿菌通過(guò)誘導(dǎo)芽孢桿菌同時(shí)發(fā)芽的方法，可以得到同時(shí)培養(yǎng)物。 然而，環(huán)境條件調(diào)控方

13、法對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響，有時(shí)會(huì)擾亂細(xì)胞的正常代謝。 研究同期生長(zhǎng)誘導(dǎo)生的作用，有助于揭示微生物細(xì)胞分裂的機(jī)制。 在上述方法的基礎(chǔ)上，也可以使用最高穩(wěn)定期的培養(yǎng)物進(jìn)行接種。 從細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線可以看出，處于最高穩(wěn)定期的細(xì)胞，由于環(huán)境條件差，細(xì)胞都處于老化狀態(tài)，如果轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基，同樣可以同時(shí)生長(zhǎng)。 連續(xù)培養(yǎng)，將微生物放入一定容積的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)生長(zhǎng)，最后收獲。 分批培養(yǎng)(batch culture )或封閉培養(yǎng)(closed culture )，培養(yǎng)基一次性加入，不補(bǔ)充，不更換。 連續(xù)培養(yǎng)(Continous culture )是在微生物全培養(yǎng)期間，能夠以一定的方法使微生物以一定的相對(duì)生長(zhǎng)速

14、度生長(zhǎng)、持續(xù)生長(zhǎng)的培養(yǎng)方法。 培養(yǎng)過(guò)程中不斷補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以相同的速度移動(dòng)培養(yǎng)物是實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)培養(yǎng)的基本原則。 連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)的控制方法，恒濁連續(xù)培養(yǎng)、不斷調(diào)節(jié)流速使細(xì)菌培養(yǎng)液的濁度保持一定、恒化連續(xù)培養(yǎng)、保持一定流速的培養(yǎng)室中的濁度低于期望值時(shí)，流速變慢、濁度上升的恒濁培養(yǎng)器的工作精度取決于光電控制系統(tǒng)的靈敏度，使用的培養(yǎng)基是必要的(1)恒濁連續(xù)培養(yǎng)，與菌體和菌體生長(zhǎng)平行的代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的發(fā)酵工業(yè)，(連續(xù)發(fā)酵)，連續(xù)發(fā)酵與單批發(fā)酵相比有優(yōu)點(diǎn)：縮短發(fā)酵循環(huán)，提高設(shè)備利用率，自動(dòng)控制容易，動(dòng)力消耗和體力勞動(dòng)強(qiáng)度降低，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定， 缺點(diǎn)：雜菌污染和菌種退化，、二)恒化連續(xù)培養(yǎng)，使培養(yǎng)液的流速保持一定，使微生物總是以低于其最高生長(zhǎng)速度的速度生長(zhǎng)繁殖。 通過(guò)將某種營(yíng)養(yǎng)素的濃度控制在經(jīng)常成為生長(zhǎng)限制因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。 控制第三節(jié)微生物的生長(zhǎng)繁殖，控制(有害)微生物的生長(zhǎng)速度，消滅不需要的微生物，在實(shí)用上有重要的意義。 抑制：生長(zhǎng)停止，但不死亡，死亡：生長(zhǎng)能力不可逆丟失，防腐：防止