引物設計實例分析DJ.ppt

1、引物設計實例分析,引物設計基本原則,引物長度（primer length） 產物長度（product length） 序列Tm值 (melting temperature) G+C含量（composition） 引物二聚體及發(fā)夾結構 （duplex formation and hairpin） 閱讀框,1. 引物的長度,一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，即Taq酶的最適溫度,2.產物的長度,擴增片段長度為100600堿基對.,3. Tm值,引物的Tm值一般控制在55-60度, 盡可能保證上下游引物的Tm值一致,一般不超過2度. 如果

2、引物中的G+C含量相對偏低,則可以使引物長度稍長,而保證一定的退火溫度. Tm=2(A+T)+4(C+G),4. 引物的GC含量,有效引物中(G+C)的比例為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。,5.堿基礎隨機分布,引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。,6. 引物自身,引物間3端的互補、二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗,引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構牙引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用

3、人工判斷，引物自身連續(xù)互補堿基不能大于3bp。,7. 引物之間,兩引物之間不應不互補性，尤應避免3端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的同源性或互補性。,8.引物的3端,引物的延伸是從3端開始的，不能進行任何修飾。3端也不能有形成任何二級結構可能，,9.引物的5端,引物的5端限定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。,10.密碼子的簡并,如擴增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子

4、的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率。,11.引物的特異性,引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續(xù)8個互補堿基同源。,任務 設計DJ-1蛋白表達引物,Plasmid 1:,Plasmid 2,第一步：檢索DJ-1mRNA基本序列,LOCUS NM_057143 1097 bp mRNA linear ROD,1 gtgccgagca cagttactgg aaggcttaac caaagttttg atgcctggga accgcgcagg 61 aaaaacacgc ggaacgtgct tcacagtggc ggctaactgc tctcgttcgc t

5、gtgcagagc 121 cgtctggcag ggttgacctc ctaaagggat attccatctt tattaatcat tagtagtgtg 181 gtcagagact tagcaccatt ggtctccccc aacctggtcc agacatttca gcagtttatc 241 ggaacagcaa caacagcaac aaaaccttca aaatttacaa gtctttaaga aatagaaatg 301 gcatccaaaa gagctctggt catcctagcc aaaggagcag aggagatgga gacagtgatt 361 cctgtg

6、gaca tcatgcggcg agctgggatt aaagtcaccg ttgcaggctt ggctgggaag 421 gaccccgtgc agtgtagccg tgatgtagtg atttgtccgg ataccagtct ggaagaagca 481 aaaacacagg gaccatacga tgtggttgtt cttccaggag gaaatctggg tgcacagaac 541 ttatctgagt cggctttggt gaaggagatc ctcaaggagc aggagaacag gaagggcctc 601 atagctgcca tctgtgcggg tcct

7、acggcc ctgctggctc acgaagtagg ctttggatgc 661 aaggttacat cgcacccatt ggctaaggac aaaatgatga acggcagtca ctacagctac 721 tcagagagcc gtgtggagaa ggacggcctc atcctcacca gccgtgggcc tgggaccagc 781 ttcgagtttg cgctggccat tgtggaggca ctcagtggca aggacatggc taaccaagtg 841 aaggccccgc ttgttctcaa agactagaga gcccaagccc tg

8、gaccctgg acccccaggc 901 tgagcaggca ttggaagccc actagtgtgt ccacagccca gtgaacctgg cattggaagc 961 ccactagtgt gtccacagcc cagtgaacct caggaactaa cgtgtgaagt agcccgctgc 1021 tcaggaatct cgccctggct ctgtactatt ctgagccttg ctagtagaat aaacagttcc 1081 ccaagctcct gacggct,第二步：利用Primer Premier 5設計引物,Primer1: 5 ATGGCAT

9、CCAAAAGAG . Primer2: 5 TCTAGTCTTTGAGAACA .,Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司開發(fā)的專業(yè)用于PCR或測序引物以及雜交探針的設計、評估的軟件，其主要界面分為序列編輯窗口（Genetank），引物設計窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和紋基分析窗口（Motif），這里我們主要介紹其引物設計功能 。,打開程序首先進入的是序列編輯參看,這是根據(jù)模板序列尋找引物的界面，在該界面中可以設定所要搜索的引物的類型，包括PCR引物，測序引物和雜交探針以及引物所在的鏈；另外也能設定搜索引物的

10、范圍，以及最終PCR產物的長度和引物的長度等。,Automatic Search 自動搜索,在結果窗口中給出了程序給該對引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和長度以及產物的長度。通過直接點擊各對引物在相應引物搜尋界面中相應的顯示引物的各種信息。包括其各種參數(shù)和各種可能存在的不利結構。,PRIMER PREMIER能即時分析引物二級結構。在左下的兩排按鈕可以顯示發(fā)現(xiàn)了何種二級結構，也顯示二級結構的自由能數(shù)值G 單位kcal/mol。,Edit Primer 引物編輯窗口可以用來設計用于定點突變的引物或分析一條已有引物序列?？梢允褂肅TRL-X CTRL-C和CTRL-V快捷鍵來實施剪

11、切拷貝和粘貼刪除當前引物序列,并從剪貼板上粘貼是分析一條已有引物的好方法。進行粘貼時Paste 粘貼窗口會激活，用以將引物序列轉化為反向互補或反向互補形式，也可以手工鍵入引物序列。一旦引物被編輯發(fā)點擊Analyze 按鈕即可分析編輯后的引物。,引物長度 引物的長度控制著引物的特異性和在PCR反應中的退火溫度.對越多數(shù)實驗適宜引物長度為18到24個堿基,等于或少于15堿基的短引物有時用于簡單的基因作圖或特殊的文庫構建library protocol ,28到35堿基的長引物對于從一系列高度相關的分子中擴增序列和特殊樣本的克隆能起到重要作用。長PCR引物能給擴增帶來更好的特異性,長引物也允許通過降

12、低退火溫度來能提高反應的靈敏度,不過長引物通常更易于形成包括發(fā)卡結構二聚體自身互補等二級結構。 理論上在合適的融鏈溫度范圍內最短的引物能在特異性和高效性間獲得較好的平衡。,為設計一條高效引物有幾個參數(shù)必須考慮PRIMER PREMIER搜索所考慮的參數(shù)依次如下 Tm 融鏈溫度：PRIMER PREMIER根據(jù)相鄰二堿基對作用理論nearest neighbor theory 來計算融鏈溫度。PCR反應的合適Tm范圍為56到63C。 GC% GC含量：對于PCR反應來說GC含量在50%左右比較合適而對于測序引物和雜交探針來說GC含量至少應為50%。 Degeneracy 多義性：當設計多義引物時

13、應盡量減少引物多義性這樣會帶來更好的特異性應盡量避免3末端的多義性因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。 3 End Stability 3 末端穩(wěn)定性：引物穩(wěn)定性影響它的錯配效率。一條理想的引物應該有一個穩(wěn)定性較強的5 末端和相對穩(wěn)定性較弱的3 末端，如果引物3 穩(wěn)定性強有可能在即使5 末端不配對的情況下造成錯配形成非特異性擴secondary bands。 而3 末端穩(wěn)定性低的引物較好的原因是在引物發(fā)生錯配時由于3 末端不太穩(wěn)定引物結合不穩(wěn)定而難以延伸。,GC Clamp GC鉗：引物與目的位點的有效結合需要有穩(wěn)定的5 末端，這一段有較強穩(wěn)定性的5 末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的

14、穩(wěn)定結合。,Secondary Structures 二級結構 二級結構是引物設計中必須考慮的一個重要因素二級結構能顯著影響反應中能與模板正確結合的引物數(shù)量。發(fā)卡結構的存在能限制引物與目的位點的結合能力，從而降低擴增效率。形成發(fā)卡環(huán)的引物則不能在PCR擴增中發(fā)揮作用。,Hairpin 發(fā)卡結構 發(fā)卡結構的形成是由于引物自身的互補堿基分子內配對造成,引物折疊形成的二級結構，并由于發(fā)卡結構的形成是分子內的反應,僅僅需要三個連續(xù)堿基配對.發(fā)卡結構的穩(wěn)定性可以用自由能衡量,自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA形成發(fā)卡環(huán)所需要的能量,如果自由能值大于0 則該結構不穩(wěn)定,從而不會干擾反應.如果

15、自由能值小于0 則該結構可以干擾反應。按下按鈕All 可以顯示其具體結構。,Dimer 二聚體 引物之間的配對區(qū)域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結構。它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增，產物二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區(qū)域在3 末端問題會更為嚴重，3 末端配對很容易引起引物二聚體擴增使用Dimer Report功能可以預測二聚體的形成。 引物二聚體及發(fā)夾結構的能量一般不要超過4.5 ，二聚體和發(fā)夾結構形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。,False Priming 錯配 如果引物可以結合除目的位點外的其他區(qū)域擴增效率將明顯降低，目的產物

16、帶將減少或出現(xiàn)涂布（smear ），PRIMER PREMIER會檢查每一條引物是否會與整個序列的其他位點形成局部的錯配，3 末端連續(xù)幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區(qū)域同樣數(shù)量的堿基配對。可以分別設定確認為錯配的3 末端或引物全長形成連續(xù)堿基配對的數(shù)量。,Pair Rating 匹配度評分 匹配度低的引物對常常不太有效，是因為在同樣退火溫度下，Tm低的引物決定擴增的特異性，而Tm高的引物更易于形成非特異性結合而造成錯誤的起始。PRIMER PREMIER會計算每一對引物的匹配度100分為滿分并按照分數(shù)按降序排列計。,Pair Rating,Formula for Determinin

17、g Single Primer Rating Rating = 100 - (G (Dimer)1.7 +G (Hairpin) )1.4 +G (False Priming)1.5) Formula for Determining Primer Pair Rating Rating = Average of sense and anti-sense primer rating - (Tm difference between primers) * 1.7) - (DG Cross Dimer) * 1.3),第三步：酶切位點,Primer1: 5 ATGGCATCCAAAAGAG （GC:6

18、0%,Tm：64） Primer2: 5 TCTAGTCTTTGAGAACA （GC:57%,Tm：66）,EcoR I : GAATTC,Primer1: 5 GAATTC ATGGCATCCAAAAGAG Primer2: 5 GGTACC TCTAGTCTTTGAGAACA,Kpn I： GGTACC,第四步 保護堿基,Primer1: 5 CCGGAATTCATGGCATCCAAAAGAG Primer2: 5 CGG GGTACC TCTAGTCTTTGAGAACA,第五步 blast驗證引物,進入網頁：/BLAST/,點擊Basi

19、c BLAST中的nucleotide blast選項,在Enter Query Sequence欄中輸入引物序列： 注：文獻報道ABCG2的引物為5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; 5-TGCCCATCACAACATCATCT-3 簡便的做法是同時輸入上下游引物。輸入上下游引物系列都從5 3。 輸入上游引物后，加上20個字母n，再輸入下游引物，如下圖：,在Choose Search Set欄中： Database根據(jù)預操作基因的種屬定了，本引物可選Human genomic + transcript或Others (nr etc.)。,在Program Selection中：選擇Somewhat similar sequences (blastn)項，如下圖：,在此界面最下面 關鍵要點擊Algo