免疫組化4免疫組化.ppt

1、免疫酶組織化學(xué)技術(shù),第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院病理科 馬大烈,第一節(jié) 基 本 原 理,抗原抗體（特異性）酶標(biāo)記抗體，通過酶與底物作用生成有色反應(yīng)物，定位組織或細(xì)胞內(nèi)抗原的一門技術(shù)。,免疫酶組化,免疫學(xué) (抗原抗體反應(yīng)),酶細(xì)胞化學(xué) (底物顯色反應(yīng)),+,特異性 敏感性 定位性 可視性,PAP法,免疫酶組織化學(xué)基本組成： 抗原 抗體 放大系統(tǒng) 顯色系統(tǒng),ABC法,免疫酶特點(diǎn)： 信號定位準(zhǔn)確 標(biāo)本可長期保存 陽性標(biāo)記與病變關(guān)系 方法簡便，易推廣,第二節(jié) 酶 和 底 物,一、酶及其特點(diǎn) 酶選擇標(biāo)準(zhǔn)： 該酶用細(xì)胞化學(xué)易于被檢出， 能被光鏡或電鏡觀察。 酶反應(yīng)產(chǎn)物須穩(wěn)定，不擴(kuò)散， 具有良好定位。, 酶易于純化

2、，獲得純制品。 酶與免疫球蛋白結(jié)合后，不喪 失其活性。,酶在PH中性液內(nèi)較穩(wěn)定。 組織中不應(yīng)存在與底物作用 的內(nèi)源性酶。,符合上述條件： 辣根過氧化物酶 鹼性磷酸酶 葡萄糖氧化酶,（一）辣根過氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不會遮蓋抗 原的結(jié)合部位 穩(wěn)定，易獲得較高純度酶 具有較高活性及特異性, 可溶性佳，生成的產(chǎn)物不擴(kuò)散 組織中內(nèi)源性酶較少 可作用于多種底物，產(chǎn)生不同 顏色 HRP穿透力強(qiáng)，易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),（二）鹼性磷酸酶（AKP） 從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取 組織穿透能力較弱 內(nèi)源性AKP較高 左旋咪唑具有抑制作用,（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物為葡萄糖，終產(chǎn)物穩(wěn)定 體內(nèi)無內(nèi)

3、源性GOD 分子量大，穿透力較弱,二、底物及其特點(diǎn) 酶底物酶底物酶產(chǎn)物（顯色）,HRP的底物： HRP的底物為低濃度的H2O2，供氫體為胺類及酚類化合物。,HRP顯色反應(yīng)： HRPH2O2 HRPH2O電子供體（氧化型）,電子供體,電子供體被氧化后，迅速改變顏色，通過聚合等反應(yīng)，生成不溶性有色顆粒，并就地原位沉淀。,HRP常用的電子供體： 3.3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)紅色，易 溶于有機(jī)溶劑，易擴(kuò)散，用水 溶性封固劑。, 4-氯-1-茶酚（4CN）藍(lán)色， 易彌散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB) 黃色,AKP底物： AKP常用的底物為-萘酚AS-B

4、1磷酸鹽 偶聯(lián)試劑：固蘭BB藍(lán)色 固紅TR紅色,第三節(jié) 酶標(biāo)記抗體法,酶標(biāo)記抗體法（Enzayme Labelled antibody）是將酶通過共價鍵結(jié)合在抗體分子上，制備成酶標(biāo)記抗體，通過抗體去尋找相應(yīng)抗原。,一、直接法 原理：HRP標(biāo)記在特異性抗體 （第一抗體）上，抗原- 抗體 HRP復(fù)合物,直接法,步驟：一步完成 特點(diǎn)：方法簡便、省時，專一 性強(qiáng)，非特異染色輕， 但敏感性差，一種標(biāo)記 抗體只能檢測一種抗原。,二、間接法 原理：HRP標(biāo)記在第二抗體上， 抗原-特異性抗體-第 二抗體 HRP復(fù)合物 步驟：二步法,組織抗原,第一抗原,第二抗體,過氧化物酶,間接法,特點(diǎn)：敏感性較直接法高，一

5、種標(biāo)記抗體能用于相應(yīng) 動物制備的多種特異性 抗體，檢測多種抗原。 但較直接法費(fèi)時，非特 異染色稍重。,第四節(jié) 酶 抗 酶 法, 制備抗酶抗體 制備PAP復(fù)合物,酶橋法,組織抗原,第一抗體,第二抗體,第三抗體（抗酶抗體）,HRP,一、PAP法 原理：抗原-特異性抗體-第 二抗體（橋抗體）- PAP復(fù)合物 步驟：三步法,組織抗原,第一抗原,第二抗體,PAP復(fù)合物,PAP法,HRP,特點(diǎn)： 敏感性較高，背景染色較輕 但特異性抗體與PAP必須為 同一種屬動物,二、雙PAP法： 原理：在PAP的基礎(chǔ)上再重復(fù) 第二抗體和PAP復(fù)合物,抗原-特異性抗體-第二抗體（橋抗體）-PAP -第二抗體- PAP復(fù)合物

6、,組織抗原,第一抗原,第二抗體,PAP復(fù)合物,雙PAP法,HRP,雙PAP法,步驟：五步法 特點(diǎn)：敏感性較高 缺點(diǎn)：但步驟多，費(fèi)時，非特 異背景重,三、APAAP法 原理：抗原-特異抗體-第二 抗體- APAAP復(fù)合物 步驟：三步法,APAAP法,特點(diǎn)：非特異背景較輕，不受內(nèi) 源性酶的干擾。 但產(chǎn)物易溶于有機(jī)溶劑,第五節(jié) 卵白素-生物素法,Avidin為一種鹼性糖蛋白，由 四個相同亞基組成 Biotin小分子維生素 Avidin和Biotin具有較高親和力,一 、ABC法 Avidin Biotin Complex 原理：酶標(biāo)記Biotin形成酶素化 Biotin,酶素化BiotinAvidi

7、n - ABC 復(fù)合物 抗原-特異抗體- Biotin標(biāo)記 第二抗- Avidin Biotin HRP,組織抗原,第一抗體,第二抗體,HRP,生物素,卵白素,ABC法,步驟：三步法 特點(diǎn)：敏感性較高，特異性強(qiáng)， 應(yīng)用范圍廣, 某些臟器存在內(nèi)源性生物素 干擾 Avidin與核酸及細(xì)胞膜中磷脂 有非特異反應(yīng),SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法,二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： Biotin標(biāo)記第二抗體,LSAB法, HRP標(biāo)記Avidin 抗原-特異性抗體

8、-Biotin標(biāo)記第二抗體-Avidin HRP復(fù)合物,步驟：三步法 特點(diǎn)：敏感性高，特異性強(qiáng)， 方法簡便,第六節(jié) 多聚合物酶法,多聚合物酶法,HRP-多聚合物-抗體 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,組織抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 方法,原理：采用一種具有惰性的多聚 化合物作為骨架，將特異 性抗體和HRP，同時標(biāo)記 在多聚合物分子上，形成 HRP-多聚合物-特異性 抗體。,步驟：一步法 特點(diǎn)：快速，簡便，特異性強(qiáng)， 敏感性高 但商品化種類不全， 價格昂貴,二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System 原理：HRP -多聚合物-第二 抗體,組織抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,EnVisionTM方法,特點(diǎn)： 敏感性高：（1 mole復(fù)合物中含70mole HRP和10 mole第二抗體）,特異性強(qiáng)： 復(fù)合物內(nèi)無內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾。,第七節(jié) 基本操作步驟,抗原修復(fù) 內(nèi)源性過氧化物抑制 正常血清封閉 第一抗體,第二抗體 酶標(biāo)記體 DAB- H2O2顯色,第八節(jié) 抗原定位及非特異染色,組織細(xì)胞 固定問題 脫蠟不徹底 內(nèi)源性過