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文檔簡介
1、芽孢桿菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)及堿性磷酸水解酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?。掌握細(xì)胞反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究方法;將還原糖和生物質(zhì)的測定原理和方法結(jié)合起來。掌握酶促反應(yīng)速度的實(shí)驗(yàn)決定。4.掌握最大反應(yīng)速度rmax和米氏常數(shù)Km的測量方法。第二個(gè)實(shí)驗(yàn)原理,對(duì)細(xì)胞的反應(yīng):實(shí)驗(yàn)可以獲得不同T的基質(zhì)濃度Cs值和Cx值(細(xì)胞濃度)。動(dòng)力學(xué)參數(shù)KS,max需要。必須求出,測定時(shí)間區(qū)間T內(nèi)細(xì)胞濃度平均值。堿性磷酸水解酶堿性條件下磷酸單酯水解催化劑。酶催化反應(yīng)機(jī)理:可以推導(dǎo)出米氏方程:通過在不同基質(zhì)濃度CS中測定反應(yīng)速度R,可以確定rmax和Km。在510nm波長上非顏色地測量ODM值,以計(jì)算酶的活性(反應(yīng)速度R)。Na2HP
2、O4,H2O,堿性磷酸水解酶,特定pH,T,催化反應(yīng):醌化合物(紅色),AAP,鐵氰化鉀,OH,3種,培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器,桿菌亞基(NH4)2so 41%;KCl 0.1%;CaCl 20.1 mmol/l;MgCl 21m mol/l:Na2 hpo 420mol/l;0.1%的酪蛋白水解溶于0.1mol/LTris-HCl緩沖區(qū)(pH7.4)。150ml三角瓶,每瓶50ml,115,滅菌30min,冷卻。(星期二下午)30.1mol/LTris-HCl緩沖(pH7.4)40.1mol/L pH8.8Tris-乙酸緩沖540mmol/L底物溶液60.5mol/L氫氧化鈉溶液70.3%
3、 5 DNS試劑甲苯12吸管,刻度管,容量瓶,濾紙,三角瓶,布漏斗,電子秤,恒溫水浴,搖床,干燥,721分光光度計(jì)4茄子試驗(yàn)方法和程序,1。種子液制備(半單位)枯草桿菌在固體斜培養(yǎng)基中激活后。連接8個(gè)裝有50ml Tris-培養(yǎng)基的150ml三角瓶,在30振動(dòng)下用種子液培養(yǎng)18h。(星期三下午2336030),2。發(fā)酵液制備(組)包括上述培養(yǎng)的種子液50ml tris10個(gè)裝有培養(yǎng)基的150ml三角瓶,接種量5 (V: V),37振動(dòng)中0h,1h,表1發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),3枯草桿菌堿性磷酸酶的制備,2瓶種子液,酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究,反應(yīng)前:反應(yīng)后:酶活性(單位)=OD5101000=(OD510
4、反應(yīng)后OD510反應(yīng)前)1000,r是酶活性。氣質(zhì)濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響rmax和Km的測定,13個(gè)試管,編號(hào),根據(jù)下表正確操作。用空管零,510nm波長比色測定A510nm。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果,1 .發(fā)酵動(dòng)力學(xué)確定,發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,制作,確認(rèn)max和Ks。決定發(fā)酵動(dòng)力學(xué)。2 .氣質(zhì)濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響rmax和Km的測量,酶促反應(yīng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理,在坐標(biāo)紙上制作1/r1/CS圖,得出Km和rmax值。3,5二硝基水楊酸比色法(DNS方法)在還原糖、附錄1,1,1原理、一定范圍內(nèi),還原糖的數(shù)量與褐色紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比,在540nm波長上測定光密度值,可以通過調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出還原糖的數(shù)量。2試
5、劑,1。3,5二硝基水楊酸試劑(DNS試劑)2。1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液體,7個(gè)25ml刻度試管,編號(hào),下表操作。2 .建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,將上述各寬容液均勻混合后,在540nm波長下用空寬容液調(diào)節(jié)0,以測量吸光度值。以光密度值為橫坐標(biāo),以葡萄糖毫克數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以10個(gè)試管為例,按表格操作。均勻混合各管后,測定各管的光密度。用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的空管溶液調(diào)節(jié)0。,3 .糖的測定,每杯濃度(mg/ml)=每還原毫克數(shù)/0.3,在標(biāo)準(zhǔn)曲線中闡明相應(yīng)的還原糖含量,并根據(jù)下面的公式計(jì)算發(fā)酵液每杯濃度。菌體(CX)測量:附錄2,生物量測量方法有濁度法和直接計(jì)量法等。本實(shí)驗(yàn)兩組采用濁度法,兩組直接采用計(jì)量
6、法。比濁法是根據(jù)菌顯液的透光量間接測定細(xì)菌數(shù)。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比,因此可以用色度計(jì)測定菌液的光密度(OD值),表示樣品菌液濃度。具體操作:將培養(yǎng)0 h,1h,2h,2.5h,3h,3.5h,4h,4.5 h,5h,5.5 h的菌懸浮液均勻搖晃,以560nm波長的0D值測定為CX。使用未接種的培養(yǎng)基作為空對(duì)照組。1 .濁度法、牙齒法分為濕重法和干重法。干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)過濾(或離心)后,在105烤箱中烘干至恒重(11.5hr),冷卻至室溫,稱重。具體操作:首先將干燥的濾紙重量放在W1(g)、發(fā)酵液過濾、上清液保存在冰箱里進(jìn)行糖濃度測定,從菌體和濾紙105烤到恒重,然后叫濾紙及菌體重量,用W2(g)標(biāo)記,按下式計(jì)算菌體生
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