細(xì)胞凋亡的幾種檢測(cè)方法

1、細(xì)胞凋亡的幾種檢測(cè)方法1、 形態(tài)學(xué)觀察方法 （1）HE（蘇木精 伊紅染色法）染色、光鏡觀察：凋亡細(xì)胞呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。 （2）丫啶橙（AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。 （3）臺(tái)盼藍(lán)染色：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。 （4）透射電鏡觀察：可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形

2、，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。 2、 DNA凝膠電泳細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但凋亡細(xì)胞DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。 正常活細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀（LADDER)條帶；壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶3、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)核小體測(cè)定 凋亡細(xì)胞的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小

3、體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測(cè)。 檢測(cè)步驟 1、將凋亡細(xì)胞裂解后高速離心，其上清液中含有核小體； 2、在微定量板上吸附組蛋白體 3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合 4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合 4、加酶的底物，測(cè)光吸收制。 用途 該法敏感性高，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞?？捎糜谌恕⒋笫蟆⑿∈蟮牡蛲鰴z測(cè)。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測(cè)定凋亡細(xì)胞發(fā)生的絕多對(duì)量。 3、 流式細(xì)胞儀定量分析 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素

4、染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。 應(yīng)用價(jià)值 流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn)： 1)、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大，因此其反映群體細(xì)胞的凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確 2)、可以做許多相關(guān)性分析 3)、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細(xì)胞所處的細(xì)胞周期 （1）檢測(cè)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法 細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間，利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。 利用Hoechs-PI染色法，正常細(xì)胞對(duì)染料有抗拒性，熒光

5、染色很淺，凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光，而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶（PI)而呈強(qiáng)的紅色熒光。 （2）DNA片斷原位標(biāo)記法 凋亡細(xì)胞DNA片斷原位末端檢測(cè)技術(shù)是指在細(xì)胞（或組織）結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸（DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3的羥基（OH）端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測(cè)DNA裂解點(diǎn)的技術(shù)。 DNA片段原位標(biāo)記法有二種： 1、原位缺口轉(zhuǎn)移（in situ nick-translation,ISNT)技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3OH端 2、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)（in s

6、itu end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT，尤其對(duì)早期凋亡的檢測(cè)，TUNEL更為合適。 （3）檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法 原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS)遷移至細(xì)胞膜外測(cè)。磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。故利用對(duì)PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標(biāo)記上熒光素（如異硫

7、氰酸熒光素FITC），同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法（因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測(cè)，且對(duì)PI高染）進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)凋亡細(xì)胞。 結(jié)果判斷：正?；罴?xì)胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染；壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染。應(yīng)用價(jià)值：細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠

8、，是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。方法及步驟A. 直接標(biāo)記抗體（FITC標(biāo)記抗體）：(1)收集1106個(gè)細(xì)胞，800rpm離心5min，4以上冷PBS洗一次。(2)用4%多聚甲醛1ml室溫固定40分鐘，800rpm離心5min去上清。加2ml PBS重懸洗滌細(xì)胞，800rpm離心5min。(3)用1ml含5% 人血清的 PBS 重懸細(xì)胞，冰上孵育10min，800rpm離心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA 和飽和劑量的熒光標(biāo)記抗體(5105個(gè)細(xì)胞/20ul抗體)的PBS ,避光冰上放置30min,離心棄上清。 加入200ul 1% 多聚甲醛固定，待測(cè)即可。(4)用流式細(xì)胞儀檢

9、測(cè)熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。B. 未標(biāo)記抗體間接免疫熒光標(biāo)記法：（1）收集2106個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS 2ml 洗滌細(xì)胞一次，800rpm離心5min。（2）用2ml 4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞40min,800rpm離心5min；2ml PBS重懸細(xì)胞，800rpm離心5min；（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上放置10min,800rpm離心5min。（4）加入飽和劑量未標(biāo)記抗體，冰上放置40min,800rpm離心5min，用2ml冷的PBS 重懸細(xì)胞，800rpm離心5min，洗去未結(jié)合一抗，重復(fù)一次。（5）加入熒光標(biāo)記（FITC）標(biāo)

10、記的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm離心5min，去上清，PBS洗滌兩次。（6）加入0.5ml 1%多聚甲醛重懸細(xì)胞；固定待測(cè)。（7）流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值,每管計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞。C.細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及DNA倍體分析樣品（PI染色）的制備：（1）待測(cè)樣本制成單細(xì)胞懸液，然后200g離心5分鐘，棄上清。（2）用4預(yù)冷的70%冷乙醇固定，4保存 ，至少固定18小時(shí)。（3）調(diào)整細(xì)胞濃度為106細(xì)胞/毫升，取1毫升細(xì)胞懸液，用PBS洗三次，細(xì)胞重懸于1毫升PI染液中，37孵育30分鐘即可進(jìn)行流式分析。（4）PI染液終濃度為50微克/毫升，RNase A終濃度為20微克/毫升。培養(yǎng)細(xì)胞

11、染色體顯示法（1） 傳代培養(yǎng)細(xì)胞染色體顯示法培養(yǎng)細(xì)胞加秋水仙素采集分裂細(xì)胞離心低滲處理預(yù)固定固定重復(fù)固定制片染色和封片1培養(yǎng)細(xì)胞：取處于指數(shù)生長(zhǎng)期、用較大瓶皿培養(yǎng)的、8090匯合單層培養(yǎng)細(xì)胞。 2加秋水仙素：使用最終濃度為0.020.8微克/毫升營(yíng)養(yǎng)液，溫箱繼續(xù)培養(yǎng)610小時(shí)； 或用低溫封閉法：把培養(yǎng)細(xì)胞置于4條件下612小時(shí)后，再于37溫箱繼續(xù)培養(yǎng)610小時(shí)處理（加秋水仙素）。 3采集分裂細(xì)胞：可利用分裂中期細(xì)胞體變圓與底物附著不牢特點(diǎn)，此時(shí)手持培養(yǎng)瓶，左右反復(fù)橫向水平搖動(dòng)，令培養(yǎng)液在培養(yǎng)細(xì)胞表面反復(fù)沖刷。應(yīng)用此法可使90的中期分裂細(xì)胞從瓶壁脫落，注意勿用力過(guò)猛，以防多量非分裂細(xì)胞脫落影響觀

12、察。 4離心：收集培養(yǎng)液，1000轉(zhuǎn)/分鐘離心510分鐘。 5低滲處理：吸除上清液、加入預(yù)溫至37的0.075M KCl溶液，在溫箱中靜置2030分鐘。 6預(yù)固定：向懸液中加新鮮1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打調(diào)勻，此措施能起到先使細(xì)胞表面輕微固定，可防止固定后細(xì)胞粘連成塊。 7固定：離心，同4，吸除上清液，加新鮮固定劑510ml；加固定劑時(shí)要用一手微斜持離心管，另手用吸管吸取固定劑，把固定劑逐滴滴在離心管壁上，使之慢慢流入離心管中，然后輕輕吹打均勻，置1520分鐘。 8重復(fù)7，末次離心后，小心吸除大部分上清，據(jù)懸液中細(xì)胞密度大小，余下固定液0.5 1ml。 9制片：用滴片法制片，按如

13、下步驟：徹底洗凈載物片，勿留任何油脂，置冰箱中儲(chǔ)備備用。滴片前現(xiàn)從冰箱中取出冷載物片1片，在載物片表面出現(xiàn)細(xì)微水氣時(shí)，立即向片的一側(cè)滴23滴細(xì)胞懸液，滴片時(shí)的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥，或用吹風(fēng)機(jī)熱風(fēng)吹干亦可。如此制備好的標(biāo)本可置盒中備用或立即進(jìn)行染色觀察。 10 染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa 1份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合，染色10分鐘后，水洗、晾干、可直接觀察。如標(biāo)本需要保存或做長(zhǎng)時(shí)間觀察，可過(guò)二甲苯兩次后，用中性樹(shù)膠封片后，再過(guò)二甲苯，然后封片亦可。（2）人末梢血微量全血培養(yǎng)染色體顯示法1培養(yǎng)液準(zhǔn)備：取15ml培養(yǎng)瓶數(shù)個(gè)，每瓶?jī)?nèi)分別

14、充入5ml培養(yǎng)液（pH 7.2），內(nèi)含：1640培養(yǎng)液（含1015小牛血清），PHA 0.1ml，青霉素100單位和鏈霉素100微克/毫升 培養(yǎng)液 2抽血針管準(zhǔn)備：取25ml針管一支，在消毒后的無(wú)菌操作臺(tái)或無(wú)菌操作箱中安裝好注射器，無(wú)菌抽肝素（100 U/ml BBS）少許濕潤(rùn)針管，如動(dòng)作迅速不用肝素亦可。 3采血：用棉簽75酒精給患者或獻(xiàn)血者的皮膚消毒兩次，縛止血帶，靜脈取血12ml。無(wú)菌操作迅速向每一瓶培養(yǎng)中加血0.40.5ml，如系外出采血，安裝針管及分裝血液兩步驟亦可在無(wú)菌條件略差的環(huán)境內(nèi)操作，但動(dòng)作要迅速，以減少污染；在采血量不多或不應(yīng)抽血的情況下，亦可在耳垂、手指肚（無(wú)名指）用刺血

15、針采血。 4培養(yǎng)和加秋水仙素：37溫箱中培養(yǎng)到6072小時(shí)之間，此時(shí)細(xì)胞分裂相最多，向每培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加秋水仙素，最終濃度0.020.08微克/毫升營(yíng)養(yǎng)液，再培養(yǎng)46小時(shí)。 5低滲：1000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，吸除上清液，加入預(yù)溫過(guò)的0.075M KCl溶液10ml，置溫箱中低滲處理1520分鐘。6其余步驟與處理傳代細(xì)胞法相同。（3）羊水細(xì)胞培養(yǎng)1.抽取羊水：無(wú)菌抽取羊水10-20ml，立即注入無(wú)菌離心管2.離心分離：1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄去上清，留0.5ml.3.培養(yǎng)：加培養(yǎng)液4ml（含小牛血清1ml），用NaHCO3調(diào)PH至6.8，置37度培養(yǎng)，在溫箱培養(yǎng)7-10天，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞

16、或上皮樣細(xì)胞生長(zhǎng)；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升營(yíng)養(yǎng)液，作用10-12小時(shí)。4.其余步驟與傳代細(xì)胞染色體制備方法相同。一般染色體制片程序1、 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞一個(gè)T75或T25瓶。2、 將培養(yǎng)基換成10ml DMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培養(yǎng)基，處理12小時(shí)。3、 將細(xì)胞培養(yǎng)液倒掉，馬上加入34ml 0.1%胰蛋白酶，并立即搖晃0.51min。當(dāng)在顯微鏡下看到分裂相細(xì)胞脫壁后，馬上加入終止液終止消化，并將分裂相細(xì)胞收集在一個(gè)15ml的離心管中，并在1200r/min離心4min。4、 將上清液倒掉，剩余50ul左右的液在管中，并輕微震動(dòng)，使細(xì)胞沉淀重新懸浮。5、

17、 加入10ml的低滲液（0.075M KCL），第一毫升要逐滴加入，并邊加邊搖晃。6、 37水浴中低滲30min。7、 再加入1ml冰冷的固定液（甲醇：乙酸=3：1 的混合液），并馬上搖勻，離心，1000r/min、10min。8、 同步驟4。9、 加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，邊加邊搖晃。10、室溫下固定30min，然后離心，1000r/min、10min。11、同步驟4。12、加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，邊加邊搖晃。13、室溫下固定15min，然后離心，1000r/min、10min。14、重復(fù)步驟1113一次。15、將離心后的上清液倒掉，并加入50100

18、ul的新鮮固定液重懸細(xì)胞。16、滴片（玻片要求是濕冷的干凈的，滴片高度要大于30cm。玻片傾斜角度1530度左右）17、鏡檢。（六）細(xì)胞的冷凍保存與復(fù)蘇（慢凍速溶） 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 在細(xì)胞凍存時(shí)加入保護(hù)劑，能大大提高凍存效果。 常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過(guò)程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。細(xì)胞凍存方法（1）、冷凍前一日提前更換半量或全量培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。 （2）、配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中，最后濃度為 5-10，混合 均勻，置于室溫下待用。（預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基，10% DMSO加基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ）（3）、按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)； (4)、將細(xì)胞懸液以8001000r/min離心5min，去