課題3　血紅蛋白的提取和分離 (6).ppt

1、課題3 血紅蛋白的提前和分離,知識(shí)回顧,1、凝膠色譜法:,2、電泳：,利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)樣品中各種分子的分離。,是根據(jù)相對(duì)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。,閱讀課本相關(guān)內(nèi)容，思考以下問(wèn)題： 1、蛋白質(zhì)的提取和分離一般分 成幾步？ 2、樣品怎樣處理？ 3、蛋白質(zhì)的粗分離？ 4、各步驟的目的和方法？,二、實(shí)驗(yàn)操作,樣品處理,（一）蛋白質(zhì)提取和分離步驟,紅細(xì)胞的洗滌,粗分離：,血紅蛋白的釋放,分離血紅蛋白溶液,純化：,純度鑒定,透析,凝膠色譜法,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,1.樣品處理：-取材,（二）操作過(guò)程

2、,可選用豬、牛、羊或其他哺乳動(dòng)物的新鮮血液來(lái)分離血紅蛋白。,注意： 為防止血液凝固，在采血容器中要預(yù)先加入抗凝血?jiǎng)幟仕徕c。,思考1. 血液有哪些成分？,思考2：血紅蛋白有什么特點(diǎn)？,思考3 ： 用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,思考1. 血液有哪些成分？,亞鐵血紅素基團(tuán),答：每條肽鏈環(huán)繞一個(gè)亞鐵血紅素基團(tuán)，此基團(tuán)可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳。血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色,思考2：血紅蛋白有什么特點(diǎn)？,思考3 ： 用雞的紅細(xì)胞提取DNA，用豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞提取血紅蛋白的原因是什么？,答：雞的紅細(xì)胞具有細(xì)胞核，含有DNA，便于進(jìn)行DNA的提??；

3、豬、牛、羊等哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，血紅蛋白含量豐富，便于提取血紅蛋白。,(1)紅細(xì)胞的洗滌:,去除雜質(zhì)蛋白，利于后續(xù)血紅蛋白的分離純化.,目的:,實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理,方法：,實(shí)驗(yàn)操作 （一）樣品處理,a、采集血樣： b、低速短時(shí)間離心：（500r/min離心2min） c、吸取血漿：上層透明的黃色血漿。 d、鹽水洗滌： 下層暗紅色的紅細(xì)胞+五倍體積的0.9的NaCl溶液洗滌，攪拌10min e、低速短時(shí)間離心： f、重復(fù)以上三步步驟三次 上清液中已沒(méi)有黃色：紅細(xì)胞洗滌干凈。,方法：,初次離心后的結(jié)果,3次洗滌后的結(jié)果,思考1、洗滌操作過(guò)程中，為什么要低速短時(shí)間離心？且洗滌次

4、數(shù)不能過(guò)少？,答：速度越高和時(shí)間越長(zhǎng)會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等一同沉淀達(dá)不到分離的效果。,洗滌次數(shù)過(guò)少,無(wú)法除去血漿蛋白。,思考2、用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9的氯化鈉溶液洗滌，能否用蒸餾水代替？為什么？,答：不能， 0.9的氯化鈉溶液能保持紅細(xì)胞的滲透壓而不至于破裂，若用蒸餾水紅細(xì)胞提前破裂，使血紅蛋白與雜質(zhì)血漿蛋白混在一起，加大分離難度。,(2)血紅蛋白的釋放：,目的：,方法：,紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白,洗滌好的紅細(xì)胞加蒸餾水到原血液體積,加40體積的甲苯,置于磁力攪拌器攪拌10min,紅細(xì)胞破裂，釋放出血紅蛋白,（使紅細(xì)胞大量吸水脹裂）,(溶解紅細(xì)胞的細(xì)胞膜),(加速紅細(xì)胞的破裂),方法：,(3)分

5、離血紅蛋白溶液：,將攪拌好混合液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，以2000r/min的速度離心10 min?；旌弦悍謱樱^(guò)濾除去雜志得血紅蛋白。,將血紅蛋白和其他雜質(zhì)分離開(kāi)，便于下一步對(duì)血紅蛋白的純化。,方法：,目的：,有機(jī)溶劑 無(wú)色透明的甲苯層,脂類物質(zhì) 白色脂溶性物質(zhì)沉淀層,血紅蛋白溶液 紅色透明液體層,紅細(xì)胞破碎物沉淀 暗紅色雜志沉淀層,試管中溶液層次（4層）,血紅蛋白的分離：,濾紙 過(guò)濾,除去脂類、 紅細(xì)胞破碎物沉淀層,燒杯,分液漏斗,分出下層的 紅色透明液體,血紅蛋白,靜置 片刻,轉(zhuǎn)移,除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)和離子?；蛴糜诟鼡Q樣品的緩沖液。,2.粗分離-透析,(1)目的：,（2）透析的原理：,(

6、3)方法：,（2）透析的原理：,透析袋能使小分子自由進(jìn)出，而將大分子保留在袋內(nèi),說(shuō)明：透析袋一般用硝酸纖維素(又稱玻璃紙)制成，是一種半透膜.,取1ml的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液的燒杯中（pH為7.0），透析12h,(3)方法：,透析過(guò)程動(dòng)畫(huà)演示,小結(jié)：,1、紅細(xì)胞的洗滌： 目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。 2、血紅蛋白的釋放： 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放 3、分離血紅蛋白溶液： 離心分層；濾紙過(guò)濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。 4、粗分離-透析： 將紅色透明液體裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,1血液由血漿和各種血細(xì)胞組成，其中（ ）的含量最多。 A白細(xì)胞 B血小板 C紅細(xì)胞 D淋巴細(xì)胞,C,教學(xué)反饋,2、在采血容器中加入檸檬酸鈉 的目的是（ ） A 調(diào)節(jié)pH B 維持紅細(xì)胞的能量供應(yīng) C 防止微生物生長(zhǎng) D 防止血液凝固,D,3將攪拌好的混合液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層， 其中第3層是（ ） A無(wú)色透明的甲苯層 B脂溶性物質(zhì)的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物,C,4、一分子血紅蛋白最多可攜帶的 O2分子數(shù)和