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1、新型診斷技術(shù)與應(yīng)用,主要技術(shù),Realtime-PCR 差異顯示PCR RFLP PCR-SSCP FISH 基因芯片,一、定量PCR,對(duì)DNA或RNA樣本的靶序列進(jìn)行定量分析。 主要用于基因表達(dá)的分析、病原體核酸的檢測(cè)等 在定量PCR反應(yīng)體系中,除了常規(guī)PCR反應(yīng)所需的材料和試劑外,還必須引入內(nèi)參照系統(tǒng)。 內(nèi)參照系統(tǒng)一般選用與待測(cè)序列結(jié)構(gòu)無關(guān)的基因常用的內(nèi)參照基因是-肌球蛋白基因,熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR),又稱實(shí)時(shí)PCR,是目前較精確的進(jìn)行定量檢測(cè)PCR的方法 FQ-PCR通過熒光信號(hào)對(duì)PCR過程中產(chǎn)物量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),精確計(jì)算
2、出PCR的初始模板量,熒光信號(hào)的檢測(cè)方法: 1、DNA結(jié)合染料技術(shù) 2、水解探針技術(shù)(TaqMan probe)技術(shù) 3、雜交探針技術(shù),TaqManTM,d.NTPs,Thermal Stable DNA Polymerase,Primers,Add Master Mix and Sample,Denaturation,Annealing,Reaction Tube,l,TaqManTM,Extension Step,1. Strand Displacement,2. Cleavage,3. Polymerization Complete,4. Detection,l,實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)
3、CEA基因拷貝數(shù)在監(jiān)測(cè)胃腸癌微轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用,CEA 基因在消化系統(tǒng)上皮腺癌, 尤其是直結(jié)腸癌和胃癌中高表達(dá), 因此在腫瘤細(xì)胞內(nèi)可檢測(cè)到其轉(zhuǎn) 錄本,而在正常成人體內(nèi)極少表 達(dá)。,正常成人體內(nèi)CEA基因表達(dá),胃腸癌腫瘤組織中CEA基因的表達(dá),在腫瘤發(fā)生血道轉(zhuǎn)移時(shí),外周血 中有少量腫瘤細(xì)胞殘留。用靈敏、 特異的技術(shù)檢測(cè)到這些腫瘤細(xì)胞 中CEA基因的轉(zhuǎn)錄本,是發(fā)現(xiàn)腫 瘤早期轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。,胃腸癌患者外周血中CEA基因的表達(dá),二、差異顯示PCR(differential display PCR,DD-PCR),一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。 DD-PCR主要用于腫瘤和多種疾病的分子遺傳
4、學(xué)研究,是目前篩選基因表達(dá)差異最有效的方法。,差異顯示RT-PCR(Differential display RT-PCR),三、PCR-RFLP 利用正常序列或突變序列是否處于限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)而設(shè)計(jì)。若點(diǎn)突變處于某一限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)內(nèi),可在突變點(diǎn)兩側(cè)設(shè)計(jì)引物,使PCR產(chǎn)物含有該突變序列。用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì)正常產(chǎn)物和突變產(chǎn)物進(jìn)行水解并作電泳分離,可根據(jù)水解片段的大小和電泳位置區(qū)分二者。,RFLPRFLP診斷鐮狀細(xì)胞貧血,四、PCR-SSCP -Single Strand Conformation Polymorphism,單鏈DNA分子具有特定的二級(jí)空間構(gòu)象,取決于 該分子本身的堿基
5、組成。突變DNA的PCR產(chǎn)物經(jīng) 變性后產(chǎn)生與正常DNA空間構(gòu)象不同的兩條單鏈 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中時(shí),不同構(gòu)象的 單鏈片段具有不同的電泳遷移率,從而能區(qū)別正 常與突變的DNA 不同順序 不同構(gòu)象 不同電泳行為,PCR-SSCP 的應(yīng)用,1.基因點(diǎn)突變的監(jiān)測(cè) 2.多態(tài)性檢測(cè) 3. 外顯子的篩查 4.cDNA篩查,PCR-SSCP與RFLP比較,無需特殊的限制性內(nèi)切酶作用 可測(cè)出理論上任何一個(gè)堿基突變位點(diǎn) 操作簡(jiǎn)便,無需特殊的儀器設(shè)備及試劑 電泳條件的 改變?nèi)菀子绊慡SCP,五、PCR產(chǎn)物的序列分析(DNA sequencing),主要見于分子克隆時(shí)對(duì)于目的基因擴(kuò) 增片段的序列鑒定以及對(duì)致
6、病基因檢測(cè)時(shí) 分析擴(kuò)增片段中點(diǎn)突變的位置和性質(zhì)。 可將產(chǎn)物純化后作為模板直接測(cè)序, 也可將PCR產(chǎn)物克隆入載體后再測(cè)序,后 者測(cè)序的效果更好 ,常用T-A克隆。,Sanger測(cè)序技術(shù):,以待測(cè)序列的單鏈DNA作為模板,加入一個(gè)引物和dNTP作為底物,并加入一定比例的2,3-ddNTP,在DNA聚合酶的作用過程中,正常dNTP的摻入使鏈延伸,若ddNTP的摻入則使鏈終止,這樣就可以得到一系列長度不同的以四種ddNTP結(jié)尾的DNA片段,經(jīng)電泳后可直接讀出堿基序列。,PCR測(cè)序演示版,1,2,PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,PCR技術(shù)在分子診斷中的應(yīng)用,感染性疾病中病原微生物核酸的檢測(cè) 單基因遺傳性疾
7、病的基因診斷 多基因病相關(guān)基因的檢測(cè) 腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè) 移植配型和法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,一、感染性疾病的分子診斷,定性或定量檢測(cè)致病微生物的核酸, 已經(jīng)用于病毒、細(xì)菌和寄生蟲感染 的診斷。 動(dòng)態(tài)、定量地檢測(cè)病原體核酸能對(duì) 療效判斷和病情預(yù)后提供客觀的依 據(jù)。,SARS相關(guān)冠狀病毒的分子診斷,2003年4月,香港研究者Peiris等報(bào) 告了50 例SARS病人的臨床表現(xiàn)和 病毒學(xué)研究結(jié)果證明,新冠狀病毒 可能是SARS的致病原因。 (Lancet, 2003, 361: 9365) 其它實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)得出相同結(jié)論。,2003年4月,德國漢堡Bernhard- Nocht熱帶醫(yī)學(xué)研究所學(xué)者 Drosten
8、 等用隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù),獲得長度為 300 bp的核苷酸序列。 根據(jù)這段序列,建立了檢測(cè)新冠狀 病毒的常規(guī)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。(.org on April 10, 2003),引物和探針,BNIoutS2-BNIoutAs BNI-1片段,189 bp BNIinS-BNIinAs BNI-1片段的內(nèi)套片段,108bp BNITMSARS1BNITMSARAs2 BNITMSARP(熒光素標(biāo)記的探針) 產(chǎn)物長度:77 bp,檢測(cè)標(biāo)本 痰液、咽拭子、鼻拭子、支氣管肺 泡灌洗液 、血漿、糞便。 檢測(cè)方法 1. 逆轉(zhuǎn)錄-巢式PCR 2. 逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)PCR,結(jié) 果,病人和接觸者(具臨床癥狀)的痰 液中
9、用外套引物檢測(cè)到了病毒。 病人的其它標(biāo)本用套式PCR檢測(cè)到 病毒。,有報(bào)道顯示,在可能SARS病人 中, 病毒的檢出率為100%。 在疑似SARS病人中的檢出率為 23%。 所有健康接觸者中未檢測(cè)到病毒。,檢測(cè)病毒的3種方 法(血清學(xué)檢測(cè)、 病毒分離、PCR技術(shù))中,PCR技 術(shù)的檢出率最高。,疾病的早期即可獲得陽性結(jié)果(早 于血清轉(zhuǎn)換期)。 特異性較高(SARS患者中的陽性 率約為80%,對(duì)照中的陰性率約為 98%100%)。 現(xiàn)有的方法敏感性較差,陰性結(jié)果 不能排除病毒感染。,其他感染性疾病的診斷,HBV病毒,HIV病毒,.,二、單基因疾病的診斷,單基因遺傳病是由于某一基因結(jié) 構(gòu)的變化或由
10、其而引起的基因表 達(dá)異常所導(dǎo)致的疾病,因此用分 子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)致病基因的遺 傳缺陷是診斷這些疾病最根本的 手段。,2、DMD的分子診斷,X染色體連鎖隱性遺傳性肌肉疾病,發(fā)病率 為1/3 500個(gè)男孩 DMD基因位于Xp21.2-21.3,全長2500Kb DMD基因的突變導(dǎo)致dystrophin缺陷 檢測(cè)DMD基因的技術(shù): Southern印跡、PCR-SSCP,DMD的基因檢測(cè),是一種高發(fā)病率、高致殘、高致死的X染色體連鎖的遺 傳性疾病,在2500個(gè)活產(chǎn)男嬰中即有一個(gè)患者。 致病基因DMD的全長為250kb,有79個(gè)外 顯子。 DMD 的最主要遺傳缺陷是外顯子缺失, 約占60%70%。,D
11、MD基因外顯子缺失的檢測(cè),PCR-SSCP檢測(cè)非缺失型DMD,C 母 子,肢帶型肌營養(yǎng)不良(limb-girdle muscular dystrophy, LGMD)是一組累及肩胛、骨盆帶 和四肢近端肌肉的遺傳性疾病。 LGMD1:顯性遺傳(1A、1B、1C) LGMD2:隱性遺傳(2A2H) 不同類型的LGMD不僅在遺傳學(xué)上具高度異質(zhì) 性(不同致病基因,不同基因突變),臨床表 現(xiàn)亦十分不一致,臨床診斷和分類十分困難。,LGMD2B的基因定位和遺傳缺陷的研究,診斷標(biāo)準(zhǔn):,LGMD的診斷必須符合以下2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之一: 1. 致病基因與已知的某一LGMD基因位點(diǎn) 連鎖 2. 檢測(cè)到致病基因編碼產(chǎn)物的缺
12、陷,先證者 男性,56歲。 初中時(shí)發(fā)覺體育活動(dòng)受限,且無法踮腳站立。 以后癥狀逐漸加重,并伴有下肢肌肉萎縮。四 年前來我院就診時(shí)已無法行走,四肢肌肉萎縮 明顯,尤以雙側(cè)小腿為甚。肌電圖示肌源性損 害,CK值3倍高于正常范圍。,家系資料,致病基因編碼產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果,先證者LGMD2B基因的編碼蛋白dysferlin 條帶密度與正常對(duì)照相比有明顯下降,其余各蛋白條帶與正常對(duì)照相比無明顯改變。,免疫熒光檢測(cè)骨骼肌dysferlin,C P,DYSF基因突變的檢測(cè),在DYSF基因的突變熱點(diǎn)區(qū)篩查,以期 找出導(dǎo)致 dysferlin缺陷的基因突變。 逆轉(zhuǎn)錄PCR 產(chǎn)物作序列分析,G,DYSF基因檢測(cè)結(jié)果,
13、cDNA第6425/6426位(52號(hào)外顯子)缺失 1個(gè)G堿基 (6425/6426 del G)。 第2019位密碼子agg agc,下游讀碼 發(fā)生移碼突變,使第2035位密碼子 atg tga (53號(hào)外顯子,M 2035 X)。,終止密碼的提前產(chǎn)生是 dysferlin缺陷的 原因。 是尚未報(bào)道的一個(gè)新突變,也是中國第 一例DYSF基因突變。 根據(jù)患者病史、體征和分子診斷實(shí)驗(yàn)結(jié) 果,這是一個(gè)由于 DYSF 基因突變?cè)斐?相應(yīng)編碼產(chǎn)物缺陷而導(dǎo)致的疾病。,三、多基因病的分子診斷,多基因病具一定的遺傳因素,家庭 發(fā)病率高于人群發(fā)病率,但是疾病 的產(chǎn)生都以一定的環(huán)境條件為誘因, 遺傳因素在其中所
14、起作用程度各異。,多基因病中的遺傳因素是若干個(gè) 易感基因微小作用的累加,某一 易感基因結(jié)構(gòu)的變化不足以導(dǎo)致 疾病的產(chǎn)生。,人類基因組多態(tài)性是多基因病基因 診斷的基礎(chǔ),易感基因多態(tài)性的檢 測(cè)能幫助我們理解多基因病發(fā)生的 機(jī)制,有助于對(duì)疾病的診斷和分類。,高血壓候選基因多態(tài)性分析的應(yīng)用前景,臨床分型 靶器官損傷 個(gè)體化治療,基因多態(tài)性與鹽敏感性高血壓,-內(nèi)收素 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 上皮鈉通道血管緊張素原 心鈉素2腎上腺素能受體 SAG蛋白亞單位3,ACE基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷,疾病 研究報(bào)告數(shù) I D D D 冠心病 30 + 11 % + 32 % 心肌梗死 15 + 12 % + 39 %
15、 腦卒中 5 + 22 % + 94 % 高血壓腎病 19 + 10 % + 53 % 糖尿病腎病 11 + 40 % + 56 % * 與II型相比,DD型和ID型發(fā)生上述疾病的危險(xiǎn)性增高程度 (145個(gè)ACE基因I/D多態(tài)性研究49959例的薈萃分析),基因多態(tài)性與高血壓靶器官損傷,腦卒中 載脂蛋白E -纖維蛋白原 血管緊張素原 血管緊張素II的1型受體 內(nèi)皮型一氧化氮合酶 心鈉素,冠心病 副氧酶 凝血因子V 凝血因子VII 載脂蛋白B,TOHP試驗(yàn)中的AGT基因研究,目的:觀察AGT基因分型與限鈉鹽攝入及減輕體重后的 血壓變化和高血壓發(fā)病率間的關(guān)系 對(duì)象:1509例 基因分析:AGT基因G-A多態(tài)性 結(jié)果: 三年后高血壓發(fā)生率(%) 對(duì)照組 限鹽組 減輕體重組 AA型 45 28 25 GG型 32 41 32 Hunt SC,et al: Hypertension, 1998;32:393-401,基因多態(tài)性分析指導(dǎo)抗高血壓藥物的選擇,藥物種類 基因 利尿劑 -內(nèi)收素 ACE抑制劑
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