熒光定量分析方法.ppt

1、熒光分析法第二講（1學時）,要求： 1.掌握熒光強度與物質濃度的關系，定量分析方法； 2.了解熒光分光光度計與熒光分析技術新技術。,第二節(jié) 熒光定量分析方法,一 熒光強度與物質濃度的關系： 由于熒光物質是在吸收光能而被激發(fā)之后才發(fā)射熒光的，因此溶液的熒光強度與該溶液中熒光物質吸收光能的程度以及熒光效率有關。 溶液中熒光物質被入射光(I0)激發(fā)后，可以在溶液的各個方向觀察熒光強度(F)。但由于激發(fā)光的一部分被透過，因此，在激發(fā)光的方向觀察熒光是不適宜的。一般是在與激發(fā)光源垂直的方向觀測。,設溶液中熒光物質濃度為C，液層厚度為L。熒光強度正比于被熒光物質吸收的光強度，即：,F(I0-I),為常數，

2、其值取決于熒光效率,根據Beer定律,（2）,將(2)待人(1)，得,即,（3）,（1）,根據 ，在低濃度時，溶液的熒光強度與溶液中熒光物質的濃度呈線性關系；但當ECl0.05時，(3)式括號中第二項以后的數值就不能忽略，此時熒光強度與溶液濃度之間不呈線性關系。,為熒光定量分析法的依據。,若濃度C很小，ECl之值也很小，當ECl0.05時，上式第二項以后的各項可以忽略。所以,（4）,熒光分析法的靈敏度比紫外分光光度法高，是因為：,熒光分析法中與濃度相關的參數是熒光物質發(fā)射的熒光強度，測量的方式是在入射光的直角方向，在黑暗或很弱背景上檢測所發(fā)射光(熒光)的強度信號，測定的靈敏度取決于檢測器的靈敏

3、度，可以通過增大檢測信號的放大倍數來提高靈敏度，使極微弱的熒光也能被檢測到，可以測定很稀的溶液；而在分光光度法中與濃度相關的參數是吸光度(A=lgI0/I)，是一個比值，如果增大檢測器的放大倍數，檢測到的入射光強度和透射光強度同時增大，比值仍然不變，對提高檢測靈敏度不起作用，所以，熒光分析法的靈敏度比紫外分光光度法高，一般要高23數量級。,二、定量分析方法 1 依據：熒光強度與熒光物質濃度的關系，在低濃度時二者成線性關系：F=KC 2 熒光定量分析方法： 校正曲線法：配制空白溶液以及一系列濃度梯度的待測物的標準溶液，試樣經過相同的處理之后分別測定熒光強度：F0、Fs、Fx，然后作（ Fs -

4、F0） C 曲線，根據（FxF0)，從工作曲線上求得待測物的濃度（或含量）。,(2) 比例法：如果熒光物質溶液的工作曲線通過原點，就可選擇其線性范圍，用直接比較法進行測定： Fs-F0 = KCs ， Fx-F0 = KCx,例題：1g谷物的制品試樣，用酸處理，分離出核黃素(VB2)及少量無關雜質，加入少量KMnO4，將核黃素氧化，過量的KMnO4用H2O2除去。將此溶液移入50ml容量瓶中，稀釋至刻度。吸取25ml放入樣品池中以測量熒光強度（核黃素中常含有熒光的雜質叫光化黃）。事先將熒光計用硫酸奎寧調整至刻度100處。測定得到氧化液的讀數為6.0格。加入少量的連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)，

5、使氧化態(tài)核黃素（無熒光）重新轉化為核黃素，這時熒光計讀數為55格。在另一樣品池中重新加入24ml被氧化的核黃素溶液，以及1ml核黃素標準溶液0.5g/ml，這一溶液的讀數為92格，計算每克樣品中含核黃素的g數？(課本P2307題),解：25ml氧化液：熒光讀數6.0格，相當于空白背景； 25ml測定液：熒光讀數55格，實際核黃素的熒光讀數為55-6.0=49格； 24ml氧化液+1ml標準核黃素：熒光讀數92格； 標準核黃素0.5g/ml：熒光讀數92-6=86格；,樣品溶液的濃度為：,1g谷物配成50ml溶液，取25ml測定，故谷物中核黃素為：,第三節(jié) 熒光分光光度計和熒光分析新技術,一 熒

6、光分光光度計(fluorospectrophotometer): 1 主要部件：主要由四個部分組成即激發(fā)光源、樣品池、雙單色器系統(tǒng)、檢測器。 特點：有兩個單色器，光源與檢測器通常成直角,2 儀器的校正： 靈敏度的校正： 波長校正： 激發(fā)光譜和熒光光譜的校正：,二 熒光分析新技術簡介 1 激光熒光分析法 2 時間分辨熒光分析 3 同步熒光分析 4 膠束增敏熒光分析,小結,1.熒光(fluorescence)：物質分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光。 2.磷光(phosphorescence)：物質分子接受光子能量被激發(fā)后，經過體系間跨越再通過振動弛豫降至激發(fā)三重

7、態(tài)的最低振動能級后再返回基態(tài)時發(fā)射出的光。 3.分子熒光的產生：處于基態(tài)的分子，吸收紫外-可見光后，電子由基態(tài)激發(fā)單重態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它通過輻射躍遷和無輻射躍遷等去活化過程釋放能量而迅速返回至基態(tài)。無論處于哪一個激發(fā)單重態(tài)，通過內轉換和振動弛豫均可返回至第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)，所發(fā)射的光稱為熒光。,4.分子處于激發(fā)態(tài)后，去活化過程主要有以下六種方式：,振動弛豫(vibrational relexation)： 內部能量轉換(internal conversion)： 熒光發(fā)射： 外部能量轉換(external conversion)： 體系

8、間跨越(intersystem conversion)： 磷光發(fā)射：,熒光和磷光產生示意圖,5.熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜：可用來鑒別熒光物質，并作為選擇適當測定波長的依據。,6.溶液熒光光譜的特征： （1）斯托克斯位移：熒光波長總是大于激發(fā)光波長； （2）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長無關； （3）熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關系。,7.熒光壽命和熒光效率：是描述熒光物質的重要發(fā)光參數。,8.發(fā)射熒光的物質應具備的條件： （1）物質必須有強的紫外-可見吸收； （2）物質必須具有一定的熒光效率。,9.分子結構與熒光的關系： （1）長共軛分子具有*躍遷的具有較強的熒光強度； （2）剛性平面結構分子具有較強的熒光效率； （3）共軛體系上的取代基對熒光光譜和熒光強度有很大影響。,10.影響熒光強度的外部因素： （1）溫度； （2）溶劑； （3）pH； （4）熒光熄滅劑； （5）散射光：尤其是拉曼光,11.熒光的定量分析方法：,當ECl0.05時,12.比例定量法：,或,注意： 1.熒光物質的最大激發(fā)波長和最大熒光波長