核酸檢測培訓(xùn)

1、主要內(nèi)容,為什么要做核酸檢測？ 核酸是什么？ 怎樣進(jìn)行核酸檢測？ 市場狀況,為什么要做核酸檢測？,核酸檢測（基因檢測） 現(xiàn)知人類的疾病都與基因有直接或間接 的關(guān)系。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室所要檢測和分析的核酸 既包括人體本身的基因(DNA ) 以及反映基因 轉(zhuǎn)錄水平的mRNA , 也包括侵入人體的致病 微生物等所攜帶的外源性基因(DNA/RNA )。,傳統(tǒng)檢測試劑（酶免ELISA）,技術(shù)特點(diǎn)： 檢測目標(biāo)為蛋白, 所檢測的主要是疾病所引發(fā)的人體抗體而不是病原體本身,是一種間接、滯后的檢測方式。易操作，成本低。 固有不足： 不能夠消除對(duì)“窗口期”標(biāo)本(抗體陰性,核酸陽性)的漏檢 難于檢測病原體的不同亞型及突變型

2、 不典型血清陽轉(zhuǎn) 對(duì)免疫逃避或免疫沉寂的標(biāo)本產(chǎn)生漏檢,核酸檢測,顯著縮短窗口期:HIV窗口期縮短45%，HCV縮 短89%，HBV縮短50%。 提 高 靈 敏 度:理論上擴(kuò)增體系中單拷貝的模板 也能被檢測出。 特 異 性 好:使用熒光探針技術(shù)的PCR檢測， 幾乎沒有方法學(xué)的假陽性。 直接揭示病原體的存在 對(duì)操作者及檢測環(huán)境的要求較高 檢測成本相對(duì)較高,輸血中可傳染病原體的“窗口期”,窗口期檢測率,核酸檢測在臨床診斷中的應(yīng)用,定性診斷 血液篩查 病原體篩查診斷 SNP和耐藥突變?cè)\斷 基因型分型 遺傳病診斷 個(gè)體用藥診斷 基因鑒定和配型 ,定量檢測 病情的評(píng)估和預(yù)后判斷 抗病毒藥物療效的觀察 新藥

3、驗(yàn)證 癌基因表達(dá)差異 ,核 酸 是 什 么？,核酸（Nucleic Acid）是一種主要位于細(xì)胞核內(nèi)的生物大分子，其充當(dāng)著生物體遺傳信息的攜帶和傳遞。核酸廣泛存在于所有動(dòng)物、植物細(xì)胞、微生物內(nèi)。 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近2000種遺傳性疾病都和DNA結(jié)構(gòu)有關(guān)。腫瘤的發(fā)生、病毒的感染、射線對(duì)機(jī)體的作用等都與核酸有關(guān)。,核酸分類：DNA、RNA； DNA：dATP（A）、dTTP（T）、 dCTP（C）、dGTP（G）； RNA：ATP、UTP、CTP、GTP； 35磷酸鍵,DNA結(jié)構(gòu),單鏈DNA形成雙鏈的原則 堿基互補(bǔ)配對(duì)： G-C T-A,外部為磷酸和戊糖形成 的骨架 內(nèi)部為堿基互補(bǔ)形成的 共價(jià)結(jié)合區(qū)域 螺

4、旋結(jié)構(gòu),核酸在體內(nèi)的復(fù)制,DNA的熱變性,DNA受熱，會(huì)解開雙鏈互補(bǔ)狀態(tài)，形成單鏈；降溫會(huì)恢復(fù)雙鏈狀態(tài),怎樣進(jìn)行核酸檢測？,核酸檢測的一般流程,核酸樣品的制備： 從血液、體液、組織中提取或PCR擴(kuò)增 樣品的檢測： 核酸雜交、PCR、熒光定量PCR、PCR-ELISA等 結(jié)果判讀： 電泳、膜、熒光定量PCR儀等,核 酸 雜 交,核酸雜交是從核酸分子混合液中檢測特定大小的核酸分子的傳統(tǒng)方法。其原理是核酸變性和復(fù)性理論。即雙鏈的核酸分子在某些理化因素作用下雙鏈解開，而在條件恢復(fù)后又可依堿基配對(duì)規(guī)律形成雙邊結(jié)構(gòu)。雜交通常在一支持膜上進(jìn)行，因此又稱為核酸印跡雜交。根據(jù)檢測樣品的不同又被分為DNA印跡交（

5、Southern blot hybridization ）和RNA印跡雜交（Northern blot hybridization）。,核酸提取,PCR擴(kuò)增,探針點(diǎn)膜,交聯(lián),雜交,顯色,結(jié)果判讀,PCR,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。 DNA的復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈

6、。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。,PCR的產(chǎn)生,實(shí)時(shí)熒光PCR,在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行分析的方法,可以進(jìn)行定量和定性檢測。,熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。 每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。,熒光定量PCR標(biāo)記方法,內(nèi)摻式染料 SYBR Green I

7、序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons Dual Probes(FRET) 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen),探針特點(diǎn),SYBR Green 融解曲線分析,SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn),優(yōu)點(diǎn): 對(duì)DNA模板沒有選擇性 適用于任何DNA 使用方便-不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針 非常靈敏 便宜,TaqMan探針法,TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn),市 場 狀 況,凱普、港龍以HPV檢測為主。浩源血篩試劑已進(jìn)入審批階段。羅氏、生物梅里埃公司有HIV檢測試劑盒，均以各自公司的專利技術(shù)為主研發(fā)。,現(xiàn)狀和趨勢,1、現(xiàn)狀：公司多、競爭激烈、同質(zhì)化；手工操作為主；缺乏規(guī)范；核心技術(shù)少； 2、趨勢：管理部門逐漸加強(qiáng)管理，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制訂中；進(jìn)口試劑以全自動(dòng)診斷平臺(tái)為主在國內(nèi)推廣，國內(nèi)廠家漸進(jìn)推出自動(dòng)化核酸提取儀器進(jìn)入市場；,實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的難點(diǎn),1、大規(guī)模適合自動(dòng)化核酸提取的樣品制備技術(shù) 2、適合篩查應(yīng)用的多重PCR技術(shù) 3、高通量全自動(dòng)的