Western Blot 相關(guān)技術(shù)操作與原理.ppt

1、Western Blot 相關(guān)技術(shù)操作與原理,是什么？,能做什么？,為什么？,怎么做？,怎么辦？,印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。,1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNADNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。,而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。,埃德溫邁勒薩瑟恩 （Edwin

2、 Mellor Southern）,是什么？,DNA重組技術(shù),siRNA的轉(zhuǎn)染技術(shù),表觀遺傳學(xué)（甲基化，miRNA）,凡是涉及蛋白水平檢測的研究，均可運用到western blot技術(shù),能做什么？,6.最后加上相應(yīng)的底物溶液，當(dāng)二抗上的酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光時,用X光片曝光，洗片后就會產(chǎn)生可見的區(qū)帶，指示目的蛋白質(zhì)的位置和強弱。,3.通過電泳將蛋白樣品分開。,5.印跡首先用封閉液（如5的脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩余的疏水結(jié)合位點，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目的蛋白質(zhì)與一抗特異性結(jié)合。洗去游離的一抗后，用再與酶標(biāo)記的二抗孵育,4.將電泳分離的蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持

3、體.轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡（blot），用于對蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測。,1.提取細(xì)胞或組織蛋白，測定總蛋白濃度,2.測定總蛋白濃度，并處理樣品,技術(shù)路線,細(xì)胞總蛋白的提取 總蛋白定量 十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 轉(zhuǎn)膜 固相免疫檢測,為什么？,怎么做？,細(xì)胞總蛋白的提取,提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。提取蛋白質(zhì)的方法很多， 鑒于后續(xù)實驗對蛋白性質(zhì)的要求不同，因此很難找到一種萬能的裂解方法。,不論采用那種方法，都應(yīng)遵循以下原則： 1盡可能采用簡單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。 2細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶

4、抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。本實驗中選用PMSF(苯甲基磺酰氟)作為蛋白酶抑制劑。 3樣品裂解液應(yīng)該新鮮制備，并且分裝凍存于-80。切勿反復(fù)凍融已制備好的樣品。,BRIPA buffer： Tris-HCl 50 mM, pH 7.4 NP-40 1% 去氧膽酸鈉 0.25% NaCl 150 mM EDTA 1 mM,目的：要獲得高豐度、高品質(zhì)的蛋白質(zhì)，以滿足后續(xù)實驗的需求,A細(xì)胞總蛋白裂解緩沖液(100 ml)： 1 PBS 80ml Tritonx-100 1ml 去氧膽酸鈉 0.5g SDS 0.1g 補1PBS緩沖液至100ml.,注意事

5、項,1.注意個人防護(hù)。PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)有致命危險。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，立即用大量水沖洗。,2.所用離心機(jī)需提前預(yù)冷。,3.為防止蛋白降解，所有操作應(yīng)在冰上完成。,4.吸取蛋白上清液時，注意不要把沉淀吸上來。,蛋白定量,Western Blot作為一項半定量實驗技術(shù)，電泳前，必須盡量使各組 之間總蛋白量基本一致;,蛋白質(zhì)總量不足可能妨礙對目的蛋白的鑒定; 蛋白質(zhì)含量太高則會使帶形扭曲,甚至?xí)绊懘穗娪痉椒ǖ姆直媪?基于以上兩方面原因，在進(jìn)行蛋白電泳之前，先要對提取的總蛋白進(jìn)行含量測定,目前常用的有五種經(jīng)典的方法，即定氮法、雙縮脲法（Biuret法）、F

6、olin酚試劑法（Lowry法）、紫外吸收法以及考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍，比Biuret法靈敏100倍以上。定氮法雖然比較復(fù)雜，但較準(zhǔn)確，往往以定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。值得注意的是，這后四種方法并不能在任何條件下適用于任何形式的蛋白質(zhì)，因為一種蛋白質(zhì)溶液用這四種方法測定，有可能得出四種不同的結(jié)果。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點。,在選擇方法時應(yīng)考慮： 實驗對測定所要求的靈敏度和精確度； 蛋白質(zhì)的性質(zhì)； 溶液中存在的干擾物質(zhì)； 測定所要花費的時間。,本實驗中用的Bradford法基

7、于以下原理： 考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比,此法的不足之處： 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。,Bradford法由于其突出的優(yōu)點，正得到越來越廣泛的應(yīng)用 ： 1.靈敏度高：可精確定量 11000 g/ml 的蛋白樣品。 2.測定快速、簡便：只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，

8、只需要5分鐘左右。染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。 1 小時內(nèi)吸光度變化不超過10%。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴(yán)格地控制時間。 3.干擾物質(zhì)少：如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。,注意事項,1制作的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線如不規(guī)律，應(yīng)重新再做。 2如果待測樣品濃度高（如組織提取物），可用生理鹽水稀釋1020倍后再測定；如樣品濃度低，可適當(dāng)減少稀釋倍數(shù)。使測得的OD值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi)。,SDS-PAGE電泳,SDS 是一種離子性的表面活性劑,它有強離

9、子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈。 當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時，它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)的疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以磺酸根離子外露與水分子作用。大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的SDS 后 ，由于 SDS 帶強負(fù)電荷，使蛋白質(zhì)原先所帶電荷顯得微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)所帶電荷一致 ，所以不同蛋白質(zhì)的遷移率大小就主要由蛋白分子大小這一主要因素決定。,SDS聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度 聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍 丙烯酰胺濃度(%)線性分離范圍KDa 15 10-43 12 12-60 1

10、0 20-80 7.5 36-94 5.0 57-212,注意事項,1.丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在聚合前具有很強的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱量或配膠時應(yīng)戴手套及口罩 2.過硫酸銨會緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制 3.溶液中一旦加入TEMED，應(yīng)立即混勻并快速灌注入玻璃夾槽中 4.為保持電泳的平衡，在無樣品孔中也應(yīng)加入適量的4蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液 5.正確連接電泳連線（負(fù)極在上，正極在下）以保證蛋白由上向下方向電泳 6.電泳盡量在4冰箱中進(jìn)行,轉(zhuǎn)膜,凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，常用的固相支持物有NC （硝酸纖維素）膜、尼龍膜及PVDF（聚

11、偏氟乙烯）膜。 選擇膜的主要根據(jù)有： 1.膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量） 2.膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。?3.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適合用于所選顯色方法，信噪比好） 4.如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜,膜,注意事項,1.轉(zhuǎn)膜液最好現(xiàn)配現(xiàn)用 2.檢查樣品凝膠是否與轉(zhuǎn)移槽的 “-”側(cè)保持一致 ，以確保樣品蛋白由凝膠轉(zhuǎn)移至膜上 。 3.NC膜應(yīng)小心操作，防止破裂,固相免疫檢測,轉(zhuǎn)移結(jié)束后，借助抗原抗體反應(yīng)，利用ECL（增強化學(xué)發(fā)光）發(fā)光或DAB（3,3二氨基聯(lián)苯胺）顯色技術(shù)檢測目的蛋白。,ECL試

12、劑采用氧化還原反應(yīng)的原理：利用二抗上標(biāo)記 的辣根過氧化物酶(HRP)，使底物發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而產(chǎn)生化學(xué)。,DAB顯色原理：DAB在HRP作用下形成紅褐色不溶產(chǎn)物 ，從而指示目的蛋白位置及強弱。 ECL發(fā)光相對于DAB顯色而言，具有發(fā)光持久，靈敏度高(一般可達(dá)到pg級以上 )等優(yōu)點，且DAB具有致癌性。 應(yīng)用化學(xué)發(fā)光，膜可以再生檢測其他蛋白。,注意事項,1.處理膜的過程中，切勿使膜干掉 （否則導(dǎo)致背景增高） 2.選擇合適的一抗及二抗?jié)舛龋舛雀卟灰欢ㄐЧ?，過高會導(dǎo)致背景變黑） 3.選擇合適的封閉液 （如果膜需要再生，最好選用脫脂奶粉，而非BSA） 4.應(yīng)考慮試劑的發(fā)光強度及其衰滅時間，來選

13、擇合適的曝光時間,結(jié)果分析,一、膜上沒有信號答：原因有很多：1 細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2 細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被降解掉了，必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶活性，并且提取過程冰上操作；3 轉(zhuǎn)膜過程出現(xiàn)失誤；4 抗體或酶失活，選擇在有效期內(nèi)的試劑；5 抗體不能識別目的蛋白，多看看說明，看該抗體是否適用于western。,怎么辦？,二、目的帶很弱答：1 標(biāo)本中靶蛋白含量低，可以加大樣品的上樣量。2 轉(zhuǎn)膜不充分，可以通過提高轉(zhuǎn)膜電流或延長轉(zhuǎn)膜時間來解決。3 抗體效價低，可以減少抗體的稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度。 三、膠片背景很臟，有什么解決方法？ 答：1 膜沒有均勻浸濕，PVDF膜轉(zhuǎn)

14、膜前應(yīng)該用100%甲醇將膜完全浸濕10秒，快速激活；2 膜或者緩沖液污染，拿取膜與吸水紙時要戴手套，及時更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液；3 封閉不充分，延長封閉時間；4抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng)，檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng)，如果有，考慮更換封閉液；5抗體濃度過高，增加抗體稀釋倍數(shù),四、條帶中出現(xiàn)單個或多個白點？ 答：膜和膠塊存在氣泡，轉(zhuǎn)膜時趕盡膜和膠塊之間的氣泡 五、制備的凝膠不平？ 答：膠板洗刷干凈，加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻，溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻，室溫較高時，操作應(yīng)迅速。,六、用于western的抗體和用于ELISA的抗體有什么不同的要求？ 答：一般來

15、說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。 七、檢測到的抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 答：抗原形成了二聚體。增多-巰基乙醇的量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。,八、做western必須要內(nèi)參嗎？ 答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義,表明的確是實驗設(shè)計的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化.所以內(nèi)參是必須做的。,MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 2005, p.35633574,內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)