食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)生鮮乳中舒巴坦敏感β內(nèi)酰胺酶類藥物檢驗(yàn)方法杯碟法征求意見稿

1、直播衛(wèi)星江蘇省地方標(biāo)準(zhǔn)dbs 32/xxxxxxx食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物檢驗(yàn)原料乳中舒巴坦敏感的-內(nèi)酰胺酶測試方法-杯碟法征求意見稿xxxx-xx-xx版本xxxx-xx-xx實(shí)施江蘇省衛(wèi)生廳發(fā)布前言本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布。食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)的食品微生物檢驗(yàn)生牛奶中舒巴坦敏感-內(nèi)酰胺酶的測定方法杯碟法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了原料乳中舒巴坦敏感-內(nèi)酰胺酶藥物的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于原料乳中舒巴坦敏感-內(nèi)酰胺酶的檢測。本標(biāo)準(zhǔn)適用于新鮮乳制品(液體或溶解乳制品)中舒巴坦敏感-內(nèi)酰胺酶的檢測。該方法的檢出限為4u/ml。2 .規(guī)范性參考文件下列文件對(duì)本文件的應(yīng)用至關(guān)重要。對(duì)于所有注明日期的參考文件，只有注明日期

2、的版本適用于本文件。對(duì)于未注明日期的參考文件，最新版本(包括所有修訂訂單)適用于本文件。衛(wèi)生部200944號(hào)關(guān)于印發(fā)牛奶和乳制品中舒巴坦敏感-內(nèi)酰胺酶檢驗(yàn)方法杯碟法的通知3設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)滅菌和培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：3.1抑菌圈測量儀或測量尺。3.2恒溫培養(yǎng)箱：361。3.3高壓釜。3.4內(nèi)徑為90毫米的：無菌培養(yǎng)皿，平坦光滑的玻璃皿，帶有瓷磚蓋。3.5無菌牛津杯：外徑(8.00.1)毫米，內(nèi)徑(6.00.1)毫米，高度(10.00.1)毫米3.6酸堿度計(jì)。3.7無菌吸管：1毫升(0.01毫升刻度值)，10毫升(0.1毫升刻度值)。3.8進(jìn)樣器：5 l 20 l，20

3、l 200 l，支持吸頭。3.9離心管：1.5毫升3.10無菌鑷子。4培養(yǎng)基和試劑除非另有規(guī)定，所有使用的試劑均為分析純，水為國標(biāo)6682規(guī)定的三級(jí)水。4.1試驗(yàn)菌株：藤黃微球菌cmcc(b) 28001，不超過14代。4.2磷酸鹽緩沖溶液：根據(jù)附錄a中的a.1。4.3青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：根據(jù)附錄a中的附錄a.24.4-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液：如附錄a的附錄a.3所述4.5舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)符合附錄a.4的規(guī)定.4.6營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：根據(jù)附錄a中的a.5。4.7抗生素檢測用培養(yǎng)基ii:根據(jù)附錄a中的a.6。5個(gè)操作步驟5.1細(xì)菌懸液的制備將藤黃微球菌接種在兩塊營養(yǎng)瓊脂平板上，在361培養(yǎng)18 24小時(shí)，將

4、兩塊營養(yǎng)瓊脂平板上的所有菌落刮入磷酸鹽緩沖液中制成新鮮菌懸液，其最終濃度應(yīng)大于11010 cfu/毫升，應(yīng)在制備當(dāng)天使用。5.2樣品的制備將待測樣品混合均勻，取1毫升待測樣品，放入1.5毫升離心管中，離心管上分別標(biāo)有甲、乙、丙、丁，每個(gè)樣品做三個(gè)平行管，共12管。同時(shí)，以磷酸鹽緩沖液為對(duì)照，進(jìn)行空白試驗(yàn)。5.3檢驗(yàn)板的準(zhǔn)備5.3.1取一個(gè)90毫米無菌玻璃培養(yǎng)皿，在底部加入10毫升無菌抗生素檢測培養(yǎng)基，并等待其凝固。5.3.2取適量培養(yǎng)基進(jìn)行抗生素檢測，加熱溶解，然后冷卻至40 45，加入4%藤黃微球菌懸液。5.3.3將5ml含藤黃微球菌懸液的抗生素檢測培養(yǎng)基蓋在底部培養(yǎng)基上，放置備用。5.4牛

5、津杯的位置如圖1所示，在盤子上標(biāo)記四個(gè)點(diǎn)a、b、c和d，并將牛津杯放在相應(yīng)的位置。圖15.5樣品的測定將-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液、舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液和青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入：青霉素5 l。舒巴坦鈉25 l，青霉素5l。c -內(nèi)酰胺酶25 ll，青霉素5 l。25微升-內(nèi)酰胺酶、25微升舒巴坦和5微升青霉素?；旌暇鶆蚝?，將上述a d樣品各200 l加入置于試驗(yàn)板上的四個(gè)無菌牛津杯中，在361培養(yǎng)18 24 h，并測量抑菌圈直徑。對(duì)于每個(gè)樣本，取三個(gè)平行測試的平均值。6結(jié)果報(bào)告磷酸鹽緩沖液的結(jié)果應(yīng)該是：(a)、(b)和(d)都產(chǎn)生抑菌圈；與(b)抑菌圈相比，(a)和(b)相差在3 mm以內(nèi)(含3 mm)，重復(fù)性

6、好；(c)的抑菌圈小于(d)的抑菌圈，差異在3 mm以上(含3mm)，重復(fù)性好。如果這是結(jié)果，則系統(tǒng)被建立，并且樣本結(jié)果可以如下判斷。6.1如果樣品結(jié)果中的(乙)和(丁)均產(chǎn)生抑菌圈，且(丙)和(丁)抑菌圈之間的差異大于3毫米(含)，則可根據(jù)6.1.1和6.1.2判斷結(jié)果。6 . 1 . 1(a)和(b)的抑制區(qū)之差大于3毫米(含3毫米)，重復(fù)性好。應(yīng)判斷樣品中添加了-內(nèi)酰胺酶，-內(nèi)酰胺酶藥物的檢測結(jié)果應(yīng)報(bào)告為陽性。6 . 1 . 2(a)和(b)的抑菌圈之差小于3毫米，重復(fù)性好。應(yīng)判斷樣品中未添加-內(nèi)酰胺酶，-內(nèi)酰胺酶類藥物檢測結(jié)果為陰性。6.2如果(a)和(b)不產(chǎn)生抑菌圈，應(yīng)在測試前稀釋

7、樣品。aa附加記錄a(規(guī)范性附錄)培養(yǎng)基a.1磷酸鹽緩沖溶液(ph 7.4)無水磷酸二氫鉀14.0克無水磷酸氫二鉀5.2g1000毫升蒸餾水在121高壓滅菌15分鐘。a.2青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取適量青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解，使其成為恒定體積為0.1毫克/毫升的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天準(zhǔn)備，當(dāng)天使用。a . 3-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確測量或稱取適量-內(nèi)酰胺酶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用磷酸鹽緩沖溶液溶解，制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)天準(zhǔn)備，當(dāng)天使用。a.4舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確稱取適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品，用磷酸鹽緩沖溶液溶解，分裝后保持在-20，不要反復(fù)凍融。a.5營養(yǎng)瓊脂蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15-20克1000毫升蒸餾水將上述組分加入蒸餾水中，混合均勻，在121高壓滅菌15分鐘。冷卻至45-60，倒入平板中。(注：如不立