細(xì)菌的分離培樣及鑒定

1、細(xì)菌分離培養(yǎng)及鑒定,細(xì)菌的分離培養(yǎng) 細(xì)菌的染色鏡檢 細(xì)菌的生化試驗(yàn),一、細(xì)菌分離培養(yǎng),1、需氧菌的分離鑒定,細(xì)菌分離培養(yǎng)一般采取“劃線法”，主要有分區(qū)劃線，十字交叉劃線等方法，具體方法可按照個(gè)人習(xí)慣選擇應(yīng)用，目的是達(dá)到使被檢材料適當(dāng)?shù)南♂專赃_(dá)到獲得獨(dú)立單在的菌落，防止形成菌苔，以致不宜鑒別其菌落性狀。,幾種常見(jiàn)的劃線方法,劃線步驟,操作方法： 1、左手持平皿，用左手的拇指、食指和中指將平皿蓋揭開(kāi)呈20左右的角度； 2、右手持接種環(huán)，從混合培養(yǎng)物中沾取少許混合物涂布在培養(yǎng)基邊緣，然后將接種環(huán)多余的混合物在火焰中燒灼，待冷卻后，再與所涂混合物的地方輕觸，在空白區(qū)劃線，后再燒灼，冷卻后再在空白區(qū)劃

2、線，反復(fù)操作，直至混合物稀釋到足夠形成單菌落。,注意事項(xiàng)： A 劃線前先將接種環(huán)稍彎曲，使其和平皿內(nèi)瓊脂面平行，不致于劃破培養(yǎng)基。 B 劃線中盡量不要重復(fù)、往復(fù)劃線，以免形成菌苔。 C 劃線接種完畢，在平皿底部寫上菌名、日期和接種者等標(biāo)記，然后倒扣培養(yǎng)。,2、厭氧分離培養(yǎng),1、接種方法與需氧菌分離接種方法相同，僅培養(yǎng)條件發(fā)生變化。 2、厭氧培養(yǎng)方法主要有：二氧化碳厭氧法、生物學(xué)方法、化學(xué)方法、物理學(xué)方法等。,二氧化碳厭氧法： * 簡(jiǎn)單的二氧化碳培養(yǎng)法可在盛放有培養(yǎng)物的有蓋玻璃缸內(nèi)，燃點(diǎn)蠟燭，蓋上玻璃缸蓋，當(dāng)火焰熄滅時(shí)，該缸內(nèi)空氣二氧化碳濃度大約增加了5%10%。 * 化學(xué)方法生成二氧化碳，碳酸

3、氫鈉與硫酸鈉或碳酸氫鈉與硫酸作用即可生成二氧化碳。 * 現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室設(shè)備中，已有二氧化碳培養(yǎng)箱，只需把二氧化碳的濃度設(shè)置成所需濃度即可達(dá)到相應(yīng)的厭氧環(huán)境。,生物學(xué)方法： * 原理：利用培養(yǎng)基中含有的植物或動(dòng)物組織消耗氧氣的原理制成。植物或動(dòng)物的組織具有呼吸作用，組織中的可氧化物質(zhì)也可以消耗培養(yǎng)基中的氧氣。 * 植物組織包括馬鈴薯、燕麥、發(fā)芽谷物等； * 動(dòng)物組織包括新鮮無(wú)菌的小片組織或加熱殺菌的肌肉、心、腦等。 * 目前比較常用的有厭氣肉肝湯培養(yǎng)基、碎肉培養(yǎng)基等。,化學(xué)方法： * 原理：利用還原性比較強(qiáng)的物質(zhì)將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣吸收。 * 連二亞硫酸鈉、碳酸鈉和氧氣反應(yīng)生成硫酸鈉、亞硫酸鈉

4、和二氧化碳，消耗環(huán)境中的氧氣； * 每100立方厘米空間用1g焦性沒(méi)食子酸及10ml 10%氫氧化鈉或氫氧化鉀，焦性沒(méi)食子酸在堿性溶液中吸收大量氧氣，生成焦性沒(méi)食橙。,物理學(xué)方法： * 原理：利用加熱、密封、抽氣等物理學(xué)方法，以驅(qū)除或隔絕環(huán)境及培養(yǎng)基中的氧氣，使其形成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌的生長(zhǎng)。 * 常用的方法有厭氧罐法、真空干燥器法、高層瓊脂法、加熱密封法等。,3、純培養(yǎng)與移植,*培養(yǎng)皿接種到斜面、單菌落接種到增菌肉湯、穿刺培養(yǎng)。 培養(yǎng)皿接種到斜面：右手執(zhí)無(wú)菌接種棒，無(wú)菌條件下，左手打開(kāi)平皿蓋，用接種環(huán)挑取單菌落，立即取瓊脂斜面小管，將管口火焰滅菌。右手小指夾住管塞拔出，將接種針深入到待接小

5、管中，從斜面底部開(kāi)始劃曲線，從下至上直至斜面頂端為止。管口通過(guò)火焰滅菌后，蓋好管塞。最后標(biāo)注菌名、時(shí)間和接種者，置適宜條件培養(yǎng)。 *單菌落移植到肉湯培養(yǎng)基中增菌：挑取單菌落過(guò)程如上所述，接種到肉湯小管內(nèi)，置于適宜條件培養(yǎng)。 *穿刺培養(yǎng)：半固體移植采用穿刺法接種，方法基本與純培養(yǎng)接種相同，差別在用接種針挑取單菌落，垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)。,注意事項(xiàng)： A 接種環(huán)（針）火焰燒灼滅菌后要稍冷卻后再挑取菌落； B 打開(kāi)平皿，接種過(guò)程保持無(wú)菌狀態(tài)，盡量靠近酒精燈燃心； C 接種后，培養(yǎng)小管或平板要置于適宜條件，利于細(xì)菌生長(zhǎng)； D 穿刺培養(yǎng)，接種針要直刺直出，不要反復(fù)戳刺； E 芽孢菌耐殺滅，培養(yǎng)芽孢菌的實(shí)驗(yàn)室

6、最好單獨(dú)使用，否則要徹底滅菌。,二、細(xì)菌抹片的制備及染色,1、細(xì)菌染色原理,由于細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分不同，因此具有毛細(xì)管、滲透、吸附和吸收等物理作用及離子交換、酸堿親和等化學(xué)作用。 利用各種染料對(duì)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生的各種物理、化學(xué)作用，使其著色情況具有差異，便于鏡檢觀察。,2、細(xì)菌抹片的制備,A 玻片準(zhǔn)備：用95%酒精浸泡或滴95%酒精23滴，用潔凈紗布擦拭，然后在酒精燈外焰上拖過(guò)幾次，若油漬比較頑固，可滴12滴冰醋酸，用紗布擦拭后，在酒精燈外焰上拖過(guò)幾次。處理過(guò)的載玻片應(yīng)清晰透明，潔凈而無(wú)油漬，滴上水后能均勻展開(kāi)，附著性好。,B 抹片： 液體材料：如液體培養(yǎng)物、血液、滲出液、乳汁等，可直接用滅菌

7、接種環(huán)沾取一環(huán)材料，在載玻片中央均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。 非液體材料：如菌落、膿、糞便等，現(xiàn)用接種環(huán)取少量生理鹽水置于載玻片中央，然后在用滅菌接種環(huán)沾取少量材料，在液滴中混合，均勻涂布成適當(dāng)大小的薄層。 組織臟器材料：可先用鑷子夾持中部，然后用滅菌剪刀剪去一小塊，用其新鮮切面在載玻片上壓印或涂抹成一薄層。,C 干燥：一般采取自然干燥法。 D 固定：火焰固定和化學(xué)固定 火焰固定：干燥好的抹片涂抹面向上，背面在酒精燈外焰上來(lái)回?cái)[動(dòng)幾次，略加熱，但不能太熱，不燙手為宜。 化學(xué)固定：血液、組織臟器的抹片做姬姆薩染色不用火焰固定用甲醇固定。將已干燥的抹片浸入甲醇中23min，自然揮發(fā)干燥。,3、細(xì)菌染

8、色方法,染色方法主要有革蘭染色法、美藍(lán)染色法、抗酸染色法、瑞氏染色法和姬姆薩染色法。 以下以革蘭染色法為例簡(jiǎn)要介紹操作方法。,革蘭染色法： * 原理：機(jī)理仍不清楚，一般認(rèn)為與細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分有關(guān)。 革蘭陰性菌細(xì)胞壁含有較多的脂類，當(dāng)以95%酒精脫色時(shí)，脂類被溶去，使細(xì)胞壁孔隙變大，盡管酒精處理能使肽聚糖孔隙變小，但因?yàn)殡木厶呛枯^小，細(xì)胞壁收縮有限，故能讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物被酒精洗脫出細(xì)胞壁之外，而被后來(lái)紅色的復(fù)染劑染成紅色。 革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁所含脂類少，肽聚糖多，酒精脫色時(shí)，細(xì)胞壁孔隙縮小到不易讓結(jié)晶紫與碘形成的紫色染料復(fù)合物洗出細(xì)胞壁外，而被染成紫色。,操作方法： 1

9、、在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸銨結(jié)晶紫溶液，12min后，水洗； 2、滴加革蘭氏碘溶液于抹片媒染，作用13min后，水洗； 3、滴加95%酒精于抹片上脫色，作用2030s，水洗； 4、滴加沙黃水溶液或石炭酸復(fù)紅溶液復(fù)染1min，水洗； 5、用吸水紙吸干或自然干燥，鏡檢； 6、結(jié)果，革蘭陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色，革蘭陰性菌呈紅色。,注意事項(xiàng),A 制作抹片固定時(shí)溫度不能過(guò)高，溫度過(guò)高會(huì)使細(xì)胞壁中蛋白變性，染色中染液的滲出會(huì)有影響； B 革蘭染色法中，酒精濃度不能過(guò)高，也不能過(guò)低。此外，酒精脫色時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，不要超過(guò)30s； C 瑞氏染色法中，由于染料中有沉淀，所以要避免沉淀附著在抹片上影響鏡檢觀察； D 染色水洗，水盡量用蒸餾水，水的流速不要過(guò)大，防止將細(xì)菌洗脫。,三、細(xì)菌生化試驗(yàn),生理生化鑒定管的選擇原則并非越多越好,應(yīng)選擇一組能鑒