蛋白定量與純度分析.ppt

1、生物大分子活性物質定量與純度分析 1 蛋白質定量測定 2粘多糖的定量 3核酸含量的測定 比色法測定 菲林試劑法 孚爾根染色法 紫外法測定 蒽酮法 定磷法 氮元素法測定 旋光法 二苯胺法 重量法測定 地衣酚法 紫外吸收,2 蛋白質純度分析 光譜法分析 層析法分析 電泳法分析 N末端法分析 生物活性法分析,.,第一節(jié) 蛋白質定量分析 1概況 1.1蛋白含量 蛋白質定量分析通常是指測定蛋白質溶液中的蛋白質的量或蛋白質粉劑中蛋白質的量。在進行蛋白質含量測定時，首先根據(jù)蛋白質的物理化學性質的特性和實驗室的現(xiàn)有條件來確定測定方法。蛋白質含量測定方法有很多，大致可以分為四類， 重量法 定氮法 比色法 氨基酸

2、推算法等,采用的測定方法不同得到的測定結果有差異。每-種方法有它獨特的優(yōu)點，但是也有它的局限性。 在上述幾種測定方法中測定的數(shù)據(jù)最準確的，最可靠的屬于定氮法和氨基酸推算法。這兩種測定方法都是通過測定分子中的氮元素或分子結構來確定蛋白質含量的。因此，測得的數(shù)據(jù)相對比較準確，但是它的實驗步驟比較多，操作比較繁瑣。其他的測定方法相對簡單一些，是實驗室常用的技術，靈敏度相對低一些。 測定蛋白質含量通常要采用兩種以上的方法，要根據(jù)蛋白質的某些特性選擇不同的方法進行測定。將多種方法測得的結果綜合考慮。,1.2 蛋白質濃度測定 蛋白質定量分析的方法很多，采用的定量分析方法不同其測定的基本原理也同；得到的結果

3、有一定的差異。每一種測定方法有它的優(yōu)點，也有它的不足之處。在實際工作中要根據(jù)蛋白質的特性采取相應的方法。在諸多分析方法中使用的最多的是比色法。下面分別簡單介紹各種定量分析的基本原理和方法。,1.3測定基本條件 待測溶液在一定的波長照射下會產(chǎn)生光吸收，在一定的濃度范圍內光吸收值的大小與溶液濃度成正比。因此只要測出待測溶液的光吸收值和基準溶液的光吸收值。便可知道待測溶液的濃度，推算出蛋白質的含量。比色分析要考慮以下幾個條件： (1)溶液 在蛋白質的定量分析中，大部分都足采用比色法，而比色法的溶液可分兩大類，即一類是有色溶液，另一類是無色溶液。,1.,a.有色溶液 這是根據(jù)蛋白質與某些化中試劑反應生

4、成的一類有色溶液，該溶液能與單色光具有互補作用，生成互補色。利用光的互補原理進行比色測定。有色溶液包括以下二種 本色溶液：蛋白質分子中含有變色基團或顯色基團，在溶液中會產(chǎn)生顏色，如血紅蛋白，血藍蛋白，鐵蛋白，細胞色素C等。 顯色溶液：蛋白質與某些化學試劑反應產(chǎn)生顏色，如雙縮脲，福林酚，茚三酮等試劑。 染色溶液：蛋白質與某些燃料結合，被染上顏色，如考馬斯亮藍，氨基黑等染料。,b.無色溶液 根據(jù)蛋白質分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處有最大吸收峰，肽鍵在215nm處有最大吸收峰，利用最大吸收峰的特性進行比色測定。,(2)單色光 單色光的互補性：有色溶液與相應的單色光生成新的互補色,(4)朗伯-

5、比耳定律(Lambert-Beer) 朗伯-比耳定律(Lambert-Beer)，也稱之為光吸收定律。比色測定要完全遵循朗伯-比耳定律。是指在一定的濃度范圍，溶液的濃度與光吸收值成正比。用公式表示為： 光吸收值(A) =lg(1/T)= KCL T為透射比，K為常數(shù)，C為溶液濃度，L為光程（吸收層厚度） 朗伯-比耳定律同時反映了溶液厚度L和濃度C對光吸收的關系，測定的光吸收值隨光的波長、溶液濃度和溶液的性質不同而變化。,2測定方法： 2.1比色測定 2.1.1雙縮脲法： (1)原理 蛋白質分子中含有肽鍵(CO-NH-)，因此，具有雙縮脲反應的特性。在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色的絡合物

6、，絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正。所以它是蛋白質和肽類物質的特異性測定方法。但此法測定靈敏度不高，一般測試濃度在1-10mg之間，尤其適合于肽類物質的測定。,(2)方法： 將蛋白溶液和雙縮脲試劑顯色反應，然后在540nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標準品為基準液繪制標準曲線。 (3)影響因素： 干擾雙縮脲測定的因素包括： 在性質上類似于氨基酸的化合物，如有機胺類 肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑，可使Cu2+還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。,2.1.2福林-酚(Lowry)法： (1)原理： 福林-酚法測定蛋白質是在雙縮脲法的基礎上發(fā)展起來的。是在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色

7、的絡合物，然后該絡合物再與還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑反應產(chǎn)生深藍色溶液。此法適合于蛋白類的定量分析，靈敏度較高，測試范圍在25-250g之間，但專一性不強。 (2)方法： 將蛋白溶液利福林-酚試劑生成顏色反應，然后在640nm處比色測定，以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標準品為基準液繪制標準曲線。 (3)影響因素： 干擾此測定的因素包括：在性質上類似于氨基酸或肽的緩沖劑。如呈色反應，Cu2+容易被還原，出現(xiàn)紅色沉淀物，干擾測定。,2.1.3考馬斯亮藍法： (1)原理： 考馬斯亮藍G250是一種甲基取代的二苯基甲烷，分子中含有多個磺酸基的染料，在465nm處有最大光吸收值?？捡R斯亮藍G250的磺酸基能與

8、蛋白質結合形成復合物，引起該染料的最大光吸收值的位置發(fā)生位移，移至595nm處出現(xiàn)最大光吸收值。由于蛋白質-染料復合物具有很強的光吸收，可大大提高測定蛋白質的靈敏度，對蛋白類的定量分析，最低測試量在1g以上。,(2)方法： 將蛋白溶液和考馬斯亮藍G-250試劑反應生成深藍色，然后在595nm處比色測定。以牛血清清蛋白或者以被測蛋白標準品為基準液繪制標準曲線。 (3)影響因素： 某些去污劑如Triton-100，SDS等對測定均有一定的干擾。,2.2紫外光吸收法： 2.2.1標準曲線法 (1)原理： 蛋白質分子中含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸，酪氨酸，組氨酸的等)，在280nm處有最大吸收峰。蛋白質

9、在最大吸收峰max波長處的吸光值的強弱與蛋白的濃度成正比。這種方法適合于蛋白質分子中含有較多芳香族氨基酸的蛋白質進行定量分析，對某些含芳香族氨基酸較少的蛋白質，測定靈敏度較低，如膠原蛋白。,(2)方法： 在實際工作中紫外光吸收法最常用的一種蛋白質方法，它是以配制一系列不同濃度的蛋白質標準溶液以不含被測蛋白的溶液為參比溶液，在同樣條件下測定標準溶液的吸光度，將測得的數(shù)據(jù)繪制成標準曲線，然后在同樣條件下測定未知樣品的吸光度，從標準曲線上查得未知樣品的濃度。此法測量比較準確，但使用的標準曲線隔一段時間進行校正。,2.2.2消光系數(shù)法： (1)原理： 蛋白質分子中含有芳香族氨基酸，在280nm處的特定

10、吸光值。蛋白質分子中所含氨基酸數(shù)量不同，它們在280nm處吸光值的強弱就有差異。因此，每一種純的單一蛋白質在280nm處有一個特定的消光系數(shù)。如果已知某個蛋白質的消光系數(shù)，只要在280nm處測定出該蛋白吸光值就可以計算出其相應的含量。計算公式如下：,測得吸光值 N 1000 測得吸光值 N 10 蛋白質濃度(mg/m1) = - = - 消光系數(shù) 100 消光系數(shù) 式中的N為稀釋倍數(shù)，10是常數(shù)，是指在標定消光系數(shù)時，蛋白溶液的濃度為100ml溶液中含有1000mg蛋白質，在計算公式中約分得到常數(shù)10。,例如：胰蛋白酶的消光系數(shù)是13.5。將胰蛋白酶溶液稀釋100倍，測得的光吸收值是0.27，

11、通過上述公式計算其濃度。 0.2710010 蛋白質濃度(mg/m1) = - = 20 13.5,(2)方法： 將待測蛋白稀釋成一定濃度在280nm處測定吸光值(測得的吸光值處落在0.1-1.0范圍內)。 (3)影響因素： 在蛋白質的混合溶液中或在280nm有干擾物質存在時，對該溶液測定均有較大的影響。不具有普遍性。測試靈敏度所不同。,2.2.3 F因子測定法 (1)原理： 由于蛋白質分子中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質具有吸收紫外光的性質。最大吸收峰的波長在280nm處。而在波長 260nm處光吸收較弱。這兩種波長吸光值的強弱與濃度成正比。通過測定蛋白質溶液在280n

12、m和260nm處的光吸收值，求出A280/A260的比值，從表中查出F因子，通過計算公式可以計算出待測蛋白質的含量。,蛋白質濃度(mg/m1) = F(l/d) A280 N F：F因子 d：比色杯的厚度 N：稀釋倍數(shù) (2)方法 取一定濃度的蛋白溶液，分別測定280nm和260nm處的光吸收值。求出A280/A260的比值，從F因子表中查出F因子。紫外吸收法測定蛋白質含量A280A260的比值與F因子的關系見表1,表1紫外吸收法測定蛋白質含量F因子表1,2.3定氮法 4.3.1凱氏定氮法： (1)原理： 因為每一種蛋白質都有其恒定的含氮量(約為14-16)，只要測出其氮元素的含量就可以推算出

13、其蛋白質的量。因此，可以通過測定有機化合物或蛋白質分子中氮元素的含量來推算蛋白質的含量。計算公式如下： 蛋白質(mg/ml) = 測得的含氮量 14 6.25 凱氏定氮法是將含氮有機化合物或蛋白質與濃硫酸共熱硝化，有機氮轉變成氨，氨又與硫酸結合生成硫酸銨，硫酸銨在堿性條件下被分解，放出氨氣，用水蒸汽蒸餾將氨氣蒸出，硼酸吸收，然后用標準堿溶液進行滴定。,(2)實驗方法： 蛋白質消化氨硫酸銨氨硼酸銨滴定含氮量 蛋白質含量。 凱氏定氮法是一種經(jīng)典方法，靈敏度高，使用的儀器比較簡單，但操作比較繁瑣，影響的因素較多，日前使用的不多。 (3) 影響因素: 空氣中的氨氣, 標準堿的濃度,凱氏定氮裝置,1.安

14、全管 2.導管 3.汽水分離管 4.樣品入口 5.塞子 6.冷凝管 7.吸收瓶 8.隔熱液套 9.反應管 10.蒸汽發(fā)生瓶,2.3.2原子吸收光譜法 (1)原理： 基本理是通過原子燈發(fā)出的被測元素的特征譜線在通過原子化器時，被待測元素的基態(tài)原子所吸收，使原子燈發(fā)出的被測元素的特征譜線強弱發(fā)生改變，通過檢測特征譜線的變化來測定原子吸收光譜，利用這些光信號的變化的強弱測定化合物中各種元素的含量。利用這一性質，通過原子吸收光譜儀測定蛋白質中的氮元素便可計算出蛋白質的量。 (2)方法： 通過原子吸收光譜儀直接測定蛋白質的氮元素，或者通消化后測定消化液中氮元素。這種經(jīng)典方法的測試靈敏度高，操作比較簡單，

15、但需要大型的原子光譜儀，一般的實驗室不具備。,2.4重量法： (1)原理： 在溶液中同時存在揮發(fā)性溶劑和非揮發(fā)溶質，結冰的溶劑在高真空度的條件下直接升華，溶質被干燥，獲得蛋白質干粉，然后進行重量分析。 (2)方法： 精確吸取一定的蛋白質溶液凍干，恒重后，稱重，即得蛋白質重量。這種方法適用于比較珍貴的樣品，重量法要求的天平的精度比較高。,3定量分析應注意的問題 要使分析方法有較高的靈敏度和準確性，選擇最佳的測定條件：是十分重要。它包括儀器測量，試樣反應和參比溶液等條件。 2.1光學儀器的最小測量誤差： 任何分光光度計都有一定的測量誤差，這是由于光學系統(tǒng)穩(wěn)定性的差異所造成的，實驗條件的瞬間變化，導

16、致讀數(shù)波動，對測定結果的準確性有一定的影響，尤其是試樣濃度過高或過低均會引起的誤差。因此，測定時合適的吸光度測量范圍是很重要的。根據(jù)Lamber-Beer定律，可以推出測定結果的相對誤差。,若要使測定結果的相對誤差最小，通過Lamber-Beer定律的方程解，從理論上得出相對誤差最小值是： 吸光度(A) = 0.434 透光率(T) = 36.8。 也就是說吸光度讀數(shù)應控制在光譜儀上最靈敏的范圍內， (A) = 0.434、(T) = 36.8。是儀器誤差最小的。,濃度測量的相對誤差與溶液透射率(T)的關系如圖所示：圖1,3.2比色測定呈色反應 在定量分析中，有許多物質的測定是通過化學反應生成

17、顏色后再進行比色測定，一般要注意下列問題 (1)顏色反應后的生成物必須在選定測定波長有較大的光吸收 (2)顏色反應后生成物理化性質必須穩(wěn)定，顯色條件容易控制，重復性好 (3)對照性好，反應物和生成物之間的最大吸收波長之差，差值一般要在60nm以上。,3.3參比溶液的選擇 根據(jù)樣液的性質不同，可選擇不同的參比溶液。 (1) 溶劑參比：當樣液的組分比較簡單，與其它組分共存對所測定波長無任何吸收劑為參比。 (2) 溶液參比：參與反應的試劑在所測定波長部分干擾，可按照顯色反應的條件，選用不加被測試樣品的溶液為參比。 (3)純水參比：試樣與共存組分在測定波長均有較大的吸收，可選用水為空白，先測出試樣和對

18、照的光吸收值，然后用試樣的吸收值減去對照的光吸收值即可。,.,4定量分析小結,第二節(jié) 蛋白質純度 1概念 1.1蛋白質純度 蛋白質的純度分析，是從蛋白質樣品中確定目標蛋白和雜質的分析方法，也是蛋白質分析中的一類重要方法。任何一個蛋白質制品從理論上說都含有二類組分，即蛋白質和雜質。 蛋白質：是樣品中主要的成分，是分析的目標蛋白 雜質：是殘留的非目標蛋白和殘留的小分子，無機鹽等 因此，蛋白質純度分析方法大致分為兩類。,(1)目標蛋白與雜蛋白的分析 (2)目標蛋白與非蛋白的分析 從廣義上說蛋白質純度一般是指樣品中是否含有雜蛋白的，不包括無機鹽和有機小分子的分析鑒定。因為有些蛋白質要在一定無機鹽和有機

19、小分子的保護下才比較穩(wěn)定。因此，某些產(chǎn)品中要添加一些小分子化合物。但是如果要進行蛋白質的含量測定，則要包括雜蛋白，無機鹽和有機小分子的測定。,1.2蛋白質純度的表示方法 一個天然蛋白或一個重組蛋白質，產(chǎn)品的純度是一個重要的指標。純度的表示方法主要根據(jù)實際用途區(qū)分。如化學試劑的純度一樣，主要有化學純，分析純，優(yōu)級純等。蛋白質的純度通常有兩種方式表示。 (1)工業(yè)用的用百分含量表示：如：95、99、99.9 (2)實驗室用的以用途表示： 有實驗室級純(1ab) 電泳純(electrophoresis) 色譜純(choromatography)。,2分析的方法： 2.1光譜法： 2.1.1光譜掃描法

20、： 一種純度的蛋白質溶液在一定的波長范圍內進行光譜掃描就會得到一個特征吸收光譜，可以根據(jù)掃描光譜的吸收曲線的形狀，吸收峰的位置，數(shù)量和大小判斷該蛋白的純度。 用紫外吸收光譜測定樣品的純度，既方便又靈敏，測得結果可靠，是常用的純度分析方法。 光譜分析的特點：主要是鑒別目標蛋白質和非蛋白類雜質。,2.1.2光吸收比值法： 一種純物質在紫外光區(qū)有其最大光吸收峰，如核酸的最大吸收峰在260nm，蛋白質的最大吸收峰在280nm。同一溶液在這兩種波場下測得的光吸收值是不同的。利用在280nm和260nm處測得的光吸收值之比，即可得到蛋白質的純度。如純核酸的標準光吸收比為A280/A260 = 0.5、純蛋

21、白的標準光吸收比為A280/A260 = 1.8。 特點：僅限于蛋白質溶液中含有核酸或核酸溶液中含有蛋白質的純度測定。 含有核酸的蛋白質溶液，可分別測定其A280和A260，由此吸收差值，用下面的經(jīng)驗公式，即可算出蛋白質的濃度。蛋白質濃度=1.45A2800.74A260 (mg/ml) 此經(jīng)驗公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測定的數(shù)據(jù)來建立的,2.2層析法： 2.2.1原理：一個純的蛋白質在穩(wěn)定的層析條件下，得到的保留值只有一個，如果得到的層析峰多于一個就可以視為不純。所以根據(jù)層析峰的數(shù)量判斷物質的純度。層析法鑒定蛋白質純度的方法有： (1

22、)保留值法 在一定的層析條件下各種蛋白質組分在層析柱內的保留值是一定的，通過測定蛋白質的層析保留值(保留時間，保留體積)就能確定蛋白質組分，從而可以判斷蛋白質的純度。如：排阻層析根據(jù)蛋白質不同的分子量可得到不同的保留體積，若流速恒定的條件下，其保留時間也是一定的。圖2,(2)基準物標定法： 已知物內標法，在被鑒定物的樣品中加入己知基準物，稱內標物。通過層析分離，從得到的層析峰的增高或峰的位置來判斷。圖3,2.2.2層析的模式 層析分析鑒定法的方法很多，但根據(jù)層析的分離機理利方法來分類，大致可分為以下幾類。 根據(jù)蛋白質質量和分子形狀的層析分離模式 根據(jù)蛋白質疏水基團多少和分子極性的差異的層析分離模式 根據(jù)蛋白質的帶