電泳圖譜的圖像分析及細(xì)胞蛋白譜的建立

1、蛋白質(zhì)組學(xué)，發(fā)表教師：張玲2007.10.11，回顧，F(xiàn)unctional analysis，、State 1，state 1，2de，第四章電泳圖像分析與細(xì)胞蛋白譜的建立， 課程內(nèi)容掌握：熟悉蛋白電泳圖像分析系統(tǒng)：使用PDQuest軟件自動(dòng)檢測、匹配和分析了解：二維電泳圖像數(shù)據(jù)庫、電泳圖像的圖像分析概要what can we get from image analysis？ 雙軸凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一，雙軸電泳可以根據(jù)等電點(diǎn)和分子量一次分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，在染色的蛋白質(zhì)再PAGE上形成密度不同、分布不均勻的復(fù)雜點(diǎn)圖案。 如何有效地分析雙向凝膠電泳圖譜，如何檢測、定量、比

2、較、分析圖像上的蛋白質(zhì)點(diǎn)，挖掘有價(jià)值的蛋白質(zhì)點(diǎn)信息是雙向電泳分析軟件亟待解決的問題。PDQuest軟件概述、PDQuest軟件顯示(imaging )、分析(analyzing )雙向電泳數(shù)據(jù)庫檢索的封裝硬件：一定的計(jì)算機(jī)配置、Pentirm 166處理器、64M內(nèi)存、3G硬件1000 windows操作系統(tǒng)軟件： PDQuest雙軸凝膠圖像分析軟件、Bio-Rad Laboratory、Hercules、CA、PDQuest軟件的使用、以PDQUEST 2-D分析軟件為例的雙軸電泳分析的基本實(shí)驗(yàn)過程凝膠的圖像處理分析和細(xì)胞蛋白光譜的建立，典型的工藝凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點(diǎn)檢測和定量：凝

3、膠配方：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)提示(report) 2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：PDQuest軟件， PDQUEST 2-D分析軟件一圖像采集與加工：雙斑點(diǎn)檢測三斑點(diǎn)匹配四數(shù)據(jù)分析與輸出，PDQuest軟件的使用，一、圖像采集與加工，一、掃描：凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，全色rgg 2 .圖像加工：用PDQUEST 2-D解析軟件打開以tiff格式保存的文件即可。 (單擊“打開”圖標(biāo)和“文件”菜單，選擇“打開”命令，選擇要保存二維圖像文件的光盤、路徑和文件名，然后雙擊文件名或單擊“打開”以打開二維圖像文件將自動(dòng)打開以tiff格式保存的文件。單擊工具欄中的“control the image d

4、isplay”圖標(biāo)，將顯示更改此對(duì)話框中的“High”和“Low”值以更改亮度的對(duì)話框。 工具欄的crop可以剪切沒有蛋白質(zhì)點(diǎn)的凝膠邊緣部分，降低分析的復(fù)雜性，但請注意，希望您分析的多個(gè)凝膠圖像剪切成相同大小。 (操作時(shí)選擇其中一個(gè)凝膠圖像，選擇要切斷的區(qū)域，然后在imageadvancecropsavecropsettings中輸入保存了crop的設(shè)定條件的名稱， 在切斷其他圖像時(shí)，只要選擇以前在imageadvancecroploadcropsettings中保存的名稱即可)二、點(diǎn)檢查、圖像的取入和加工后進(jìn)行點(diǎn)檢查。 PDQUEST 2-D分析軟件通過被稱為“蛋白質(zhì)點(diǎn)檢查指南(spot i

5、dentification wizard )”的程序?qū)崿F(xiàn)。 然后單擊spot菜單并選擇spot標(biāo)識(shí)向?qū)С绦颉?該程序首先需要手動(dòng)設(shè)定最小光點(diǎn)、最弱光點(diǎn)、最大光點(diǎn)、最小光點(diǎn)、背景值等檢測殘奧參數(shù)，然后程序進(jìn)行自動(dòng)檢測，調(diào)整檢測的靈敏度，如果檢測效果不理想，則重復(fù)該步驟。 程序允許您手動(dòng)調(diào)整條紋、背景、斑點(diǎn)和其他選項(xiàng)。 設(shè)定這些殘奧參數(shù)后，點(diǎn)擊Find spot centers，結(jié)果在凝膠圖像中檢測出的斑點(diǎn)以“字(Spot Crosshairs )”顯示，使檢測出的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)盡量適合肉眼觀察。如果輸入要保存在Parameter Set項(xiàng)中的名稱，則將保存蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的殘奧儀表，保存的殘奧儀表將自動(dòng)檢

6、測所有2d凝膠中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 單擊“Process all gels”后，將顯示“Auto-detect spots”窗口，您可以在其中選擇需要斑點(diǎn)檢測的凝膠圖像(這些凝膠)。完成蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測后，軟件將自動(dòng)關(guān)閉“gel image”和“gel spot” 在進(jìn)行斑點(diǎn)檢查時(shí)，為了將被污染的非蛋白質(zhì)點(diǎn)識(shí)別為蛋白質(zhì)點(diǎn)，或者將本來一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)識(shí)別為兩個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，或者錯(cuò)誤地識(shí)別相反的情況。 因此，在匹配之前，可以同時(shí)打開gel掃描、gel圖像和gel spot圖，然后單擊“編輯spot工具”以添加斑點(diǎn)和移除斑點(diǎn)對(duì)話框三、PDQUEST可以建立Matchset，以便在完成斑點(diǎn)匹配和蛋白質(zhì)斑點(diǎn)檢測之后，

7、對(duì)不同凝膠中的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的變化進(jìn)行比較分析。 單擊“匹配創(chuàng)建匹配”(matchcreat Matchset )將顯示“匹配”(matchset )對(duì)話框，您可以在其中輸入文件名、保存路徑、為gelspot圖像選擇(選擇)或上載文件名，然后單擊整個(gè)Matchset在單個(gè)窗口中表示，其中的子窗口分別用于表示參考圖像(用REF表示)和成員橡膠圖像(member gel )。 Matchset完成后，接下來設(shè)置標(biāo)記點(diǎn)，其作用是將凝膠上的蛋白點(diǎn)與排列位置匹配。 單擊工具欄上的“匹配工具”圖標(biāo)將顯示一個(gè)包含斑點(diǎn)匹配工具的窗口，如landmark、unlandmark、match gel和match all

8、 gels以及“匹配”菜單。 標(biāo)記點(diǎn)識(shí)別良好，并且優(yōu)選選擇所有成員膠上出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，盡量避開蛋白質(zhì)斑點(diǎn)聚集的地方，以不同倍率確定該蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在所有成員膠上為同一蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 只要設(shè)置至少2個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，就可以利用PDQUEST的自動(dòng)匹配功能完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的匹配。 一般設(shè)置的地標(biāo)斑點(diǎn)個(gè)數(shù)為總斑點(diǎn)的10%左右，分別用肉眼檢查應(yīng)該一致的斑點(diǎn)是否一致。 可以手動(dòng)編輯錯(cuò)誤匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)或未識(shí)別的匹配。 您也可以在此處執(zhí)行斑點(diǎn)編輯功能，然后單擊“viewinterchange all images”，使所有成員的膠水和參考膠水在Gel spot狀態(tài)下變成Gel image，在Gel imag

9、e狀態(tài)下進(jìn)行“Edit Spot Tools”，編輯蛋白質(zhì)斑點(diǎn)標(biāo)記點(diǎn)用綠色三角形標(biāo)記，每種漿料上匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)用綠色字母標(biāo)記，匹配的蛋白質(zhì)點(diǎn)不用紅色環(huán)形標(biāo)記，即表現(xiàn)出差異的蛋白質(zhì)，四，數(shù)據(jù)分析和輸出為了分析蛋白質(zhì)斑點(diǎn)之間的差異表達(dá)，PDQUEST提供了多個(gè)分析程序，包括蛋白質(zhì)斑點(diǎn)量分析和散點(diǎn)圖工具，可以打開量分析、Matchset，然后使用databaseanalysiscreateanall 下次單擊參照圖時(shí)，將出現(xiàn)一個(gè)對(duì)話框，您可以在其中輸入名稱和類型選項(xiàng)。 選擇“quaape”進(jìn)行量的比較，有兩種“比較”格式。 一個(gè)是Gel，一個(gè)橡膠兩個(gè)可以相互比較(成員橡膠和參照橡膠只能比較)。 另一

10、個(gè)是組，可以將相同樣本的多個(gè)橡膠合為一組(這是databasereplicategroup )。然后選擇a和b，分別表示2塊橡膠或2組橡膠。復(fù)制組、選擇支持交叉地址中的已刪除、已刪除或已刪除等選項(xiàng)。 選項(xiàng)的話，可以輸入倍數(shù)關(guān)系。 缺省值為2 times，如果設(shè)置了允許輸入其他數(shù)值的殘奧儀表，則在單擊go時(shí)，參考橡膠上會(huì)出現(xiàn)黃色圓形標(biāo)記的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。 如果你選擇Increased BA 2 times，這些黃色圓圈的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)在量上是b是a的2倍以上的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 為了糾正銀染對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)定量分析的影響，所有點(diǎn)的含量，單一點(diǎn)的光密度值比上膠上所有點(diǎn)的光密度值正?；?，單擊“EditNormalize”

11、時(shí)，將顯示一個(gè)對(duì)話框，左上角的enable ne 下面的窗口被激活，在Basis下面選擇totalofallvalize，這樣所有的點(diǎn)都正?；恕?單擊規(guī)范化Normalization、散點(diǎn)工具Scatter plot、Reports下的Scatter plot，顯示散點(diǎn)分析對(duì)話框，可選擇x、y軸分別表示1張膠，Markers下的倍數(shù)如果相關(guān)系數(shù)大于0.4，則表示兩者存在較大的相關(guān)，如果小于0.4，則表示比0.2小的相關(guān)，表示沒有相關(guān)。 Reports Scatter plots可讓您列印所有凝膠圖表之間的相關(guān)圖表。 點(diǎn)擊量化直方圖Graphs、ReportsMore GraphsPage G

12、raphs，則在有邊顯示一對(duì)化框，顯示所有蛋白質(zhì)點(diǎn)不同膠上的量化直方圖，在顯示要分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)的量化直方圖的情況下， 在對(duì)話框的“輸入”(Input )下，選擇“分析集”(Analysis set )以顯示一個(gè)對(duì)話框，在該對(duì)話框中，可以在“所有蛋白質(zhì)點(diǎn)”(All Match Spots )或“特定分析的蛋白質(zhì)點(diǎn)”(Specificd Analysis Set )的不同糊上、proteomicsananlysisinthecontrolandexperimental，應(yīng)用，材料：無腔眼金魚胚胎，正常眼金魚胚胎，差異點(diǎn)：量化直方圖：2D Gel Databases膀胱癌等(丹麥centerforgenomereses http:/bio base.dk/CGI-bin/celis e co2dbase大腸桿菌(在NCBI庫內(nèi)) FTP :/NCBI e co2dbase heart-2 d page人類心肌(德國柏林) http:/www.Chemie . pleisshsc-2dpage人類心臟(英國HHE mie heartsciencenter ) http:/www.hare field.n Thames.NHS.uk/nhli/protei