植物DNA的提取.ppt

1、植物DNA的提取,基本原理,DNA提取,DNA純化,操作步驟,注意事項,核酸的分類及存在,脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA),與蛋白質(zhì)結合在一起以 核蛋白（DNP）的形式存在。 在制備核酸時通常 破壞細胞壁及細胞膜來使 核蛋白釋放出來。,核酸的理化性質(zhì),DNA為白色類似石棉樣的纖維狀物，RNA的純品呈白色粉末或結晶。核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是極性化合物，一 般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有機溶 劑，它們的鈉鹽比游離酸易溶于水。 在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。,由于生物材料的差異，不可能有一種普遍適用的提純生物體DNA的方法，植物材料有堅固

2、的細胞壁，核酸含量較少，含有較多的多糖物質(zhì)和色素、核酸酶活性高等這些因素給植物DNA的分離純化帶來了困難。,DNA提取,SDS法 SDS是一種已知的能夠使蛋白質(zhì)變性的去污劑。它用于確定蛋白分子量的聚丙烯酰胺凝膠電泳。它也可以用于核酸抽提操作中破壞細胞壁及裂解核酸-蛋白復合物。在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與DNA的結合，使DNA釋放出來。SDS是有效的陰離子去垢劑，細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結合,SDS能夠破壞這種價鍵。,十二烷基硫酸鈉,CTAB法：,CTAB：十六烷基三甲基溴化銨，是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜與脂膜，使細胞中的DNA-蛋白質(zhì)復合物釋放出來，并使蛋白質(zhì)變性，使D

3、NA與蛋白質(zhì)分離。它能與核酸形成復合物。 在高鹽溶液中(0.7molL NaCl)是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3molL NaCl)時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質(zhì)、多糖類物質(zhì)分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇隨之被除去。,與SDS法相比,CTAB法的最大優(yōu)點是能很好地去除糖類雜質(zhì)，對于含糖較高的材料可優(yōu)先采用。 該方法另一個特點是在提取的前期能同時得到高含量的DNA及RNA，如果后繼實驗對二者都需要，則可分別進行純化，如只需要DNA則可用RNase水解掉RNA。,CTAB溶解細胞膜，并結

4、合核酸，使核酸便于分離。 Tris-HCl (pH8.0) 提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞。 NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使CTAB與核酸形成的復合物充分溶解，存在于液相中。 EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+ 或Mn2+ ，抑制DNase活性。 - 巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，PVP-K30（聚乙烯吡喏烷酮）可以降低酚化合物的離子化，使酚容易去除。,CTAB提取緩沖液中各試劑的作用：,注意,- 巰基乙醇有很高的毒性，吸入 、攝入或經(jīng)皮膚吸收后會中毒。 中毒表現(xiàn)有嘔吐、震顫、頭痛、昏迷，甚至死亡。對眼、皮膚有強烈刺激性。可引起角膜混濁。,DNA純化（去雜質(zhì)）,蛋白質(zhì)

5、 常用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。 RNA 常選用RNase消化 酚類物質(zhì) 提取液中加少量巰基乙醇。 多糖 提取液中加PVP。,聚乙烯吡咯烷酮, 是一種非離子型高分子化合物,操作步驟,1.稱取 200-300mg 葉片裝入 1.5ml 離心管，置于液氮中，用研磨棒研磨至粉碎，然后向離心管中加入 1000l 經(jīng)過 65預熱、含有 2%PVP 的 CTAB提取液和10l-疏基乙醇，混勻；在 65下水浴 40min-1h 其間要經(jīng)常顛倒混勻。 2. 加入 200l 醋酸鉀，混勻，冰浴 15min。10000rpm 離心 10min，取上清約900l。,3、加入

6、等體積的 Tris 飽和酚-氯仿-異戊醇（25：24：1），在搖床上充分搖動15min；10000rpm 離心10min，取上清 700l。 4、加入 1/10 上清液體積的 Rnase，混勻；37水浴 40min-1h。 5、加入等體積的的氯仿-異戊醇（24：1），搖床上搖動 15min；10000rpm 離心10min，取上清約 500l。,6. 加入 1/10 體積的醋酸鈉，2 倍體積的無水乙醇，充分混勻，4冰箱中靜置20min。 7. 10000rpm 離心 10min，棄上清。 8. 分別用 75%酒精和無水乙醇漂洗沉淀 2 次，倒掉酒精，將離心管管口朝下，自然晾干。 9. 加入 100l 1TE 溶液溶解 DNA，也可以 50助溶，保存在 4備用。,注意事項,1)選取新鮮材料，研磨迅速徹底，研磨好的材料應與 CTAB 抽提液充分混勻； 2)若提取產(chǎn)物有顏色，可能是材料中含有較多的多酚類物質(zhì)，添加巰基乙醇（25），盡可能選取幼嫩的材料；,3）收集 CTAB