分子生物學常用技術(shù)PPT課件

1、.,1,PCR 技術(shù),.,2,PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization.,.,3,The PCR cycle,95C step to denature the duplex DNA, An annealing step of around 55C to allow the primers to bind, 72C polymerization step. Mg2+,dNTPs are required in addition to template,pri

2、mers,buffer and enzyme,.,4,歷史 60s-70s：基因的體外分離技術(shù)。 Khorana（1971）：美國MIT教授、1968年諾貝 爾醫(yī)學獎得主 “經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因”。 核酸體外擴增最早設(shè)想遺忘: 當時很難進行測序和合成寡核苷酸引物； 當時(1970)Smith等發(fā)現(xiàn)了內(nèi)切酶，體外克隆基因成為可能,.,5,Kary Mullis(1985) 發(fā)明過程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶鏈反應(yīng)”一文中寫到: “這種簡單得令人驚奇，可以無限量地拷貝DNA片段的方法是在不可想象的情況下，即駕車行駛在

3、月色下的加利福尼亞山間公路上時想出來的”。 發(fā)展過程： 開始使用大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段，該酶不耐熱，每次加熱變性DNA后都要重新補加。耗時、費力、易出錯。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得自動化。,.,6,專利官司 1987年美國專利局專利授權(quán) 1989年，DuPont異議，大小公司對簿公堂，將決定誰將獲得諾貝爾獎。DuPont理由是，1971年P(guān)CR的雛形已由Khorana一系列文章闡明，并公布于眾，應(yīng)當是公共產(chǎn)權(quán)。斯坦福大學Kornberg（研究DNA聚合酶獲諾貝爾獎）也認為，任何具備生物技術(shù)知識的人都可以從Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美國專利局駁回DuPont異議

4、，地方法院判屬Cetus Cetus獲勝后馬上反訴，指出DuPont已侵犯另一項與PCR有關(guān)的專利并要求對方賠償以及不再銷售與PCR有關(guān)試劑和儀器,.,7,PCR發(fā)展速度 驚人，沒有一種技術(shù)能與之相比 引用論文最多、應(yīng)用范圍十分廣泛 1993年度諾貝爾化學獎：Mullis，與開創(chuàng)了“寡核苷酸基因定點誘變”加拿大籍英國科學家Michael Smith共獲,.,8,原理 類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，P

5、CR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。,.,9,procedures,template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10PCR buffer, Mg+, 5mmol/L dNTPs,pre-denaturation-denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30,.,10,Primer design Most imp. (1)length: 2030bp (2)G+C contents:ATCG random distributed (3)primers : no

6、complementary sequence (4)3end of the primer: no modification (5)5end of the primer:product length，can be modified (6) specificity:less than 70% homology with non-specific amplification sequence, or 8bp continuous complementary base,.,11,Primer designed with the help of computer DNA database conserv

7、ative region comparision primers or blast,.,12,PCR reaction components and their functions template：ssDNA, dsDNA mRNA needed to be RT as cDNA samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens, from ancient biological samples or in the lab. From bacterial colonies or phage pl

8、aques. DNA：very stable,.,13,primes If the PCR product is to be cloned, it is sensible to include the sequence of unique restriction enzyme sites within the 5-ends of the primers. Can amplify fragments over 10kb in length Store:純化引物在25乙腈溶液中4；凍干引物于-20可保存1-2年，液體狀態(tài)于-20可保存6個月。不用時應(yīng)-20保存。,.,14,buffer 10-50

9、mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20)。 Mg2+：for Taq polymerase activity conc.:Low:low activity high: non-specific amplification dNTPs： 貯備dNTP液：1 mol/L NaOH 調(diào)pH至中性。 貯備濃度為5-10mmol/L，終濃度為20-200umol/L，分裝-20保存。 4種dNTP濃度應(yīng)相同。,.,15,Taq DNA polymerase： from thermophilic bacteria. Taq polymerase from Thermus aquatic

10、us. other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications. mineral oil,.,16,Selection for DNA polymerase Klenow酶 早期采用 該酶不耐熱，缺點有 溫度要求低(37)，受熱即失活； 產(chǎn)物特異性不高； 積累大量的失活殘酶，使反應(yīng)產(chǎn)物純度大大降低； 擴增的最長序列約400bp（Taq酶則能擴增10kb）,.,17,thermostable DNA polymerases Taq DNA polymerase Tth DNA po

11、lymerasefrom T.thermophilus VENT DNA polymerasefrom T.litoralis Sac polymerase pfu polymerase,.,18,Taq DNA聚合酶,分離:1969年，美國黃石國家公園溫泉 分子量:94KDa 活性：在幾種水生棲熱菌中活性最高，200 000U/mg,.,19,Taq DNA聚合酶,離子需要：對Mg2+、單價離子性質(zhì)和濃度較 敏感。最適濃度為50mmol/L。 忠實性:沒有校正單核苷酸錯配功能-致命弱點。一般出錯率為210-4核苷酸/每輪循環(huán)，利用PCR克隆、測序時尤應(yīng)注意。,.,20,Taq DNA聚合酶,

12、抑制劑:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及許多其他化學藥劑。 內(nèi)源DNA:不同來源的酶可能由于制備過程中殘留的原細菌DNA或PCR產(chǎn)物的污染而含有不明來源的DNA。在使用擴增保守序列的通用引物時，會在無模板對照管出現(xiàn)擴增帶。 保存:在-20至少6個月。,.,21,PCR optimization 變性溫度和時間 92-95，富含G和C的序列，可適當提高，但過高或時間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。 退火溫度與時間 引物中G、C含量高、長度長并與模板完全配對時，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常37-55、1-2分鐘。 延伸溫度和時間 溫度：72，接近Taq酶的最適75 時間：過長會

13、導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當增加時間。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加,.,22,PCR污染及其對策 強大擴增能力+檢測的敏感性 極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性 污染源的追蹤 點樣器和加樣器;離心機;微解剖刀;濃縮用具、真空瓶;電泳裝置;紫外燈箱;乙醇或水浴鍋;冰箱門把手、實驗臺面等,.,23,污染的預(yù)防 隔離不同操作區(qū) 分裝試劑 改進實驗操作 專用加樣器 (5)結(jié)果的重演,.,24,PCR技術(shù)的應(yīng)用,.,25,遺傳性疾病,地中海貧血的基因診斷 血友病 苯丙酮尿癥,.,26,傳染性疾病,肝炎 性病 腫瘤,.,27,法醫(yī)學,個人識別、親子鑒定 1985年，英國遺傳學

14、家Jeffreys采用DNA 指紋圖譜進行個人識別和親子鑒定。 有時犯罪物證量很少，不足以用來進行DNA指紋分析，PCR有效解決這些問題。對于犯罪現(xiàn)場中遺留的少量生物物證，如一根毛發(fā)、一滴血等都可用于分析，在法醫(yī)學上認證罪犯、親子鑒定以及人的性別鑒定中PCR技術(shù)被普遍采用。,.,28,植物遺傳育種,構(gòu)建遺傳圖譜、分離目的基因、 基因定位 分子標記輔助育種 了解不同品種間的親緣關(guān)系、系統(tǒng)進化,.,29,畜 牧,畜禽病診斷:豬偽狂犬病毒、豬口蹄疫病毒、豬瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹瀉病毒、免疫缺陷病毒等檢測 性別鑒定：牛、綿羊Y染色體上特異 DNA片段 構(gòu)建基因圖譜 檢測基因整合與表達：轉(zhuǎn)基因

15、魚,.,30,其他 考古學 植物分類學 群體生態(tài)學,.,31,DNA芯片技術(shù)第一小節(jié) 概 述一、DNA芯片技術(shù)的概念 DNA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成（in situ synthesis）寡核苷酸探針，或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序的固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達的信息）。由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。DNA芯片又被稱為基因芯片（gene chips）、DNA陣列（DNA array）、cDNA芯片（cDNA chips）、寡核苷酸陣列（oligonucleotide ar

16、ray）等。,.,32,二、DNA芯片的主要類型及其特點。 根據(jù)DNA芯片的制備方式可以將其分為兩大類： 原位合成芯片（synthetic gene chip） 采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。這種芯片的集成度教高，可達10萬40萬點陣/平方厘米。但合成的寡核苷酸探針長度較短，一般為820個核苷酸殘基（nucleotide，nt），最長為50nt，因此需要使用多個相互重疊的探針片進行檢測，才能對基因進行準確的鑒定。 DNA微集芯片（DNA microchips） 將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA

17、微集芯片，又稱為DNA微集陳列（DNA microarray）。這類芯片集成度相對較低，可達1萬10萬點陣/平方厘米，但使用的探針組的來源比較靈活，可以是合成的寡核苷酸短片段，也可以是采用來自基因組的較長的DNA片段；可以是雙鏈，也可以采用單鏈的DNA或RNA片段，且技術(shù)實現(xiàn)未受到嚴格的專利控制，因而近年來發(fā)展很快。探針的長度可達100500nt。,.,33,第二節(jié) DNA芯片技術(shù)的基本原理與方法 一、芯片的制備 芯片制備的基本原理。 芯片的制備包括支持物的預(yù)處理、原位合成芯片的準備和DNA微集陳列的制備三個方面。 1.支持物的預(yù)處理 目前用于DNA芯片制作的固相支持物大致可分為兩類：實性材料

18、和膜性材料。實性材料包括硅芯片、玻片和瓷片等。膜性材料有聚丙烯膜、尼龍膜、硝酸纖維素膜等。實性材料需要進行預(yù)處理，使其表面衍生出羥基、氨基等活性基團。在合成寡核苷酸前，這些基因可與光敏材料的光敏保護基團形成共價交聯(lián)而被保護起來，合成時在光照下除去光敏保護基團，該活性基團又可以和活化的單核苷酸發(fā)生化學反應(yīng)。另一方面，這些活性基團可與DNA分子中的羥基等基團形成共價結(jié)合而使打印在上面的DNA牢固地固化在支持物表面。而膜性材料通常需要包被氨基硅烷或多聚賴氨酸等，使其帶上正電荷吸附帶負電荷的DNA探針。,.,34,2.原位合成芯片的制備 原位合成芯片是采用顯微光蝕刻（photolithography）

19、技術(shù)或壓電打?。╬iezoelectric printing）技術(shù)，在芯片的特定區(qū)域原位合成寡核苷酸而制成。顯微光蝕刻技術(shù)也稱為光引導(dǎo)聚合技術(shù)（light-directed synthesis），它不僅可用于寡核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。它是照相平板印刷技術(shù)（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸，多肽固相合成技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是原位合成芯片的主要方法。壓電打印法的裝置與普通的彩色噴墨打印機相似，所用的技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。 3.DNA微集陳列的制備 DNA微集陳列的制備采用的是預(yù)先合成DNA或制備基因探針然后打印到芯片上的方式。,.,35,二、樣品的準備 樣品的準備包括

20、樣品的分離純化、擴增和標記等過程。 1樣品的分離純化 主要從活組織或血液中獲得DNA或mRNA，這個過程包括細胞分離，破裂，去蛋白，提取及純化核酸的過程。 2樣品的擴增 測定時往往需要較多的樣品分子，因此對于分離獲得的基因組DNA通過PCR技術(shù)直接擴增，對于mRNA則需要逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA。 3.樣品的標記 標記物主要有熒光分子（cy3、cy5）、生物素以及放射性同位素等。帶有標記的dNTP（cy3或cy5-dNTP、32P-dNTP、生物素-dNTP）通過DNA或cDNA擴增的過程，摻入靶分子序列。也可以在制備引物時，摻入標記的核苷酸，擴增靶序列后，使擴增產(chǎn)物末端帶有標記物。膜性載體可以用

21、于檢測同位素標記的樣品。 樣品分子標記的質(zhì)量影響芯片檢測的靈敏度，因此，核酸的提取，反轉(zhuǎn)錄以及標記等各環(huán)節(jié)要求嚴格操作。熒光標記分辨率高于同位素標記，而且可以采用雙色，如對照樣品標紅色，待檢樣品標綠色，有助于結(jié)果分析與判斷。,.,36,三、分子雜交 芯片雜交是應(yīng)用標記的待測樣品（靶序列）與固定在載體表面的探針進行的復(fù)雜過程。 依據(jù)探針長度、類型以及不同的目的，確定溫度、鹽濃度與反應(yīng)時間。通常采用的條件是：42，50%甲酰胺，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑。也可采用65，6SSC，0.5%SDS，5Denhardt試劑或者65，10%SDS，7%PEG-800。 雜交過程類似N

22、orthern或Southern雜交，如封閉液預(yù)雜交、雜交、清洗、干燥與檢測。 四、檢測分析 芯片雜交信號的檢測可應(yīng)用熒光檢測法、質(zhì)譜法、化學發(fā)光法、光導(dǎo)纖維法以及生物傳感器法。其中激光共聚焦熒光檢測法是最常應(yīng)用的方法：激光從芯片的背面切入，聚焦于芯片與靶溶液的相互作用面，與探針雜交的靶序列標記物被激發(fā)產(chǎn)生熒光，經(jīng)過棱鏡聚焦而被檢測器檢測。樣品靶序列與探針嚴格配對雜交的分子發(fā)生強熒光信號，不完全雜交顯示較弱的信號。,.,37,第三節(jié) DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用 DNA芯片使用的基本流程。 DNA芯片使用包括待測樣品準備、分子雜交和檢測分析3個步驟。 1.待測樣品的準備 樣品的準備包括樣品的分離純化、

23、擴增和標記。 首先采用常規(guī)方法從組織細胞中分離純化樣品核酸、DNA或mRNA，由于目前芯片檢測儀器的靈敏度有限，要求對樣品中靶序列進行高效而特異地擴增。樣品的標記主要采用熒光法，也可以用生物素，放射性核素標記法。 2.分子雜交 待測樣品經(jīng)擴增和標記處理后，即可與DNA芯片上的探針陳列進行分子雜交。芯片雜交與傳統(tǒng)的Southern印跡等雜交方法類似，屬固-液雜交。探針分子固定于芯片表面，與位于液相的靶分子進行反應(yīng)。芯片雜交的特點是探針的量顯著大于靶基因片段，雜交動力學呈線形關(guān)系。雜交信號的強弱與樣品中靶基因的量成正相關(guān)。 3.檢測分析 芯片雜交及清洗后，未雜交分子被清除，帶有熒光標記的靶DNA（

24、雜交分子）與其互補的DNA探針形成雜交體，在激光的激發(fā)下，熒光素發(fā)射熒光。以掃描儀對熒光信號進行檢測和分析，通過陳列上DNA探針的原始序列將靶DNA的信息反映出來。,.,38,DNA芯片技術(shù)在醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用 DNA芯片用于基因診斷、DNA序列測定、臨床藥物篩選、法醫(yī)鑒定、 食品工業(yè)和環(huán)境監(jiān)測等方面。在醫(yī)學領(lǐng)域具有極大的潛力。 1.基因診斷 應(yīng)用DNA芯片技術(shù)可以在DNA水平檢測與疾病相關(guān)的內(nèi)源性或外源性基因；應(yīng)用表達芯片可以在mRNA水平分析同一組織在不同的發(fā)育階段，正常及病理狀態(tài)基因表達的差異，也可以分析不同組織同一基因在正常及病理狀態(tài)下表達的差異，從而為疾病診斷與分類，病原微生物分型提供科

25、學依據(jù)。 2.DNA序列測定 任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可被分解成一系列堿基數(shù)固定、錯落而且重疊的寡核苷酸，如GTACTCGAATGC分解成GTACTAGA、TACTCGAA、ACTCGAAT、CTCGAATG、TCGAATGC五個錯開1個堿基但是可重疊7個堿基的8體亞序列，當然也可以分解成7體，9體或其他整數(shù)（n體）亞序列。如果用某種方法將5個亞序列全部測定出來，就可以重新組建原來的核苷酸排列順序。應(yīng)用這一原理，可以合成或應(yīng)用已知序列的所有可能的n體寡核苷酸，并將其固定在芯片表面，然后與標記的待測靶序列雜交，經(jīng)過重新組合，即可得到待測的DNA序列。 3.臨床藥物篩選 臨床許多細菌對藥

26、物具有抗藥性，但是不同的亞型對同一藥物的敏感性不同。DNA芯片技術(shù)已被用于鑒定結(jié)核菌及非典型分支桿菌的基因型與耐利福平的相關(guān)性以及HIV產(chǎn)生抗藥性與其逆轉(zhuǎn)錄酶及蛋白酶基因突變的相關(guān)性。這為臨床選擇敏感藥物提供了有效手段。 4.其他領(lǐng)域 法醫(yī)鑒定、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測等方面，DNA芯片技術(shù)也將具有極大的潛力。,.,39,核酸分子雜交技術(shù)第一節(jié) 核酸分子雜交的基本原理,具有互補序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下 按堿基互補配對原則退火形成雙鏈的過程。 雜交的雙方是待測核酸和已知核酸序列，已知 核酸序列稱探針。 雜交有固一液相雜交和液相雜交。,.,40,.,41,.,42,一、DNA變性與復(fù)性,（一）D

27、NA變性 1、定義：某些理化因素導(dǎo)致兩條DNA鏈間的氫鏈斷裂變?yōu)閱捂湹倪^程，稱DNA變性,.,43,2、變性的方法： （1）熱變性：溫度升高到90100時，雙鏈核酸 分子鏈間的氫鍵完全斷裂。 （2）酸堿變性：pH值低于3或高于10時，雙鏈核 酸分子鏈 間的氫鍵斷裂。 （3）化學試劑變性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 雙鏈核酸分子鏈間的氫鍵斷裂。,.,44,3、變性后的理化性質(zhì)變化： 粘度降低 密度增加 紫外吸收值增加,.,45,4、GC含量與Tm值之間的關(guān)系 （G+C）%=（Tm-69.3) 2.44 Tm =(G+C)%0.41+69.3,.,46,（二）復(fù)性 1、定義：變性的單鏈核酸分子在一定

28、條件下按堿基互補原則重新結(jié)合為雙鏈核酸的過程，稱復(fù)性或雜交。 具有互補序列的兩條單鏈核酸都可互補形成雙鏈： DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。,.,47,2、復(fù)性過程 （1）單鏈分子間碰撞形成局部雙鏈 （2）局部雙鏈周圍的堿基如不配對時，雙鏈重新解離 （3）局部雙鏈周圍的堿基如配對，則形成中心序列 （4）形成完整的雙鏈分子,.,48,二、影響雜交的因素 1、核酸分子的濃度和長度： 濃度越大，復(fù)性速度越快 分子越大，復(fù)性速度越慢 單鏈探針，濃度增加，雜交效率增加 雙鏈探針，濃度控制在0.10.5g,濃度過高影響雜 交效率,.,49,2、溫度： （

29、1）DNA/DNA雜交，適宜溫度較Tm值低2025 （2）RNA/DNA或RNA/RNA雜交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探針雜交，適宜溫度較Tm值低5,.,50,3、離子強度： （1）低鹽濃度時雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加 （2）高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定，當進行序列不完全同源的核酸分子雜交時，必須維持雜交反應(yīng)液中較高的鹽濃度和洗膜溶液的鹽濃度,.,51,4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸雜交的Tm值，能降低雜交液的溫度，低溫時探針與待測核酸雜交更穩(wěn)定，當待測核酸與探針同源性不高時，加50%甲酰胺溶液在3542 雜交 （2）如待測核酸序列與探針同源性高時，則用水

30、溶液在68雜交,.,52,5、非特異性雜交反應(yīng)： （1）雜交前封閉非特異性雜交位點，減少其對探針的非特異性吸附 （2）常用的封閉物有兩類：即非特異性DNA和高分子化合物。如鮭精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脫脂奶粉,.,53,第二節(jié) 核酸分子雜交的方法 按待測核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相雜交 膜上印跡雜交 原位雜交 液相雜交 RNA酶保護分析法 核酸酶S1保護分析法,.,54,一、Southern印跡雜交 （一）待測核酸樣品的制備 1、裂解或破碎細胞 2、抽取純化基因組DNA 3、限制酶消化DNA為大小不同的DNA片段,.,55,（二）待測DNA樣品的電泳分離 1、

31、瓊脂糖濃度：分離大片段用低濃度膠 分離小片段用高濃度膠 2、凝膠電泳：凝膠具有分子篩效應(yīng)，大分子 DNA泳動慢,小分子DNA泳動快， 大小 相同的分子處于同一條帶 3、分子量標準：經(jīng)Hind消化的DNA，雜交 所用分子量標準可用核素標記,.,56,（三）凝膠中核酸的變性（堿變化） 凝膠置于NaOH溶液中使DNA變性斷裂為較短的 單鏈 DNA,中性緩沖液中和凝膠中的緩沖液,.,57,（四）Southern印跡 指將電泳分離的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定的固 相支持物上的過程,.,58,1、固相支持物的選擇 （1）理想的固相支持物應(yīng)具備的特性 具有較強結(jié)合核酸分子的能力 不影響與探針的雜交反應(yīng) 與核酸分子

32、結(jié)合穩(wěn)定牢固 具有良好的機械性能 非特異吸附少,.,59,（2）常用的固相支持物 硝酸纖維素膜：優(yōu)點是吸附能力強，雜交信號本 底低。缺點是DNA分子結(jié)合不牢固 尼龍膜：優(yōu)點是結(jié)合單鏈，雙鏈DNA的能力比硝酸 纖維素膜強；缺點：雜交信號本底高 化學活化膜：優(yōu)點：DNA與膜共價結(jié)合；對不同 大小的DNA片段有同等結(jié)合能力；缺點：結(jié)合能 力較上述兩種膜低,.,60,2、Southern印跡的常用方法 （1）毛細管虹吸印跡法,利用濃鹽轉(zhuǎn)移緩沖液的推動作用，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、

33、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的DNA片段垂直向上運動，凝膠中的DNA片段移出凝膠而滯留在膜上,.,61,（2）電轉(zhuǎn)法,利用電場的電泳作用將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上。,.,62,（3）真空轉(zhuǎn)移法,此法原理與毛細管虹吸法相同，只是以濾膜在下，凝膠在上的方式將其放置在一個真空室上，利用真空作用將轉(zhuǎn)膜緩沖液從上層容器中通過凝膠和濾膜抽到下層真空室中，同時帶動核酸片段轉(zhuǎn)移到凝膠下面的尼龍膜或硝酸纖維素膜上。,.,63,（五）Southern雜交 1、預(yù)雜交：封閉膜上能與DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含DNA探針的雜交液 2、雜交：液相中的DNA探針與膜上的待測DNA雜交 雙鏈DN

34、A探針需加熱變性為單鏈，再雜交 3、洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA,.,64,（六）雜交結(jié)果檢測 1、放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 2、比色或化學發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針,.,65,（七）Southern雜交在醫(yī)學中的應(yīng)用 1、酶切圖譜分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突變分析 4、限制性片段長度多態(tài)性的分析,.,66,二、Northern印跡雜交 1、基本原理和基本過程與Southern blot基本相同 2、鑒別RNA 3、探針可用DNA或RNA片段 4、待測樣品為總RNA或mRNA,.,67,Northern印跡與Southern 印跡的不同點 1、變性：RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持RNA處于變性狀態(tài)，DNA電泳前和電泳 中不變性 2、轉(zhuǎn)膜：RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理,Southern 印跡時，DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 3、靶核酸為RNA,.,68,三、斑點及狹縫印跡雜交 1、斑點印跡為圓形 2、狹縫印