藥品微生物驗證實例.ppt

1、,微生物限度檢查法 驗證實驗要點及實例,標(biāo)準(zhǔn)化操作,方法選擇 樣品處理 沖洗方法和條件 中和劑加入 菌液加入,標(biāo)準(zhǔn)化操作,沖洗方法 強調(diào)少量多次：50ml/次； 強調(diào)充分振搖； 操作細(xì)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不蓋濾筒下口等等。,標(biāo)準(zhǔn)化操作,中和劑加入 不同中和劑加入方式可能效果不一樣。通過我們的經(jīng)驗，基本傾向于直接加入培養(yǎng)基中效果最好。但如果某些中和劑對微生物生長不利可考慮其他步驟加入。,標(biāo)準(zhǔn)化操作,菌液加入 按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮濾器的有效性。 濾器的有效性應(yīng)由提供企業(yè)控制，用戶可采用適當(dāng)方法抽查（如檢查陽性菌液通過濾筒的流出液）。,標(biāo)準(zhǔn)化操作

2、,菌液加入 而驗證實驗主要考慮濾膜/濾器殘留抗菌物質(zhì)對陽性菌生長的影響，可以與對照濾筒比較而做出判斷，所以驗證實驗中加菌時機與方式只要與對照一致即可。,驗證實驗的幾個問題,微生物限度檢查法驗證實驗要點 驗證實驗實例,微生物限度檢查法驗證實驗要點,樣品 菌種和實驗用菌液（同無菌檢查） 回收率測定實驗 控制菌檢查的驗證 實驗器材,首先應(yīng)是合格的樣品。,微生物限度檢查樣品,微生物限度檢查樣品,樣品給藥途徑和類型決定何種控制菌檢查驗證 一般口服制劑驗證大腸埃希菌 外用制劑驗證金葡和銅綠假單胞 含藥材原粉；含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑的大腸菌群檢查驗證 含動物組織（包括提取物）口服制劑驗證沙門菌 陰道給

3、藥制劑（中成藥）驗證梭菌,抽樣量和檢驗量分別單列一項。 抽樣量 一般抽樣量為檢驗用量（2個以上最小包裝）的3倍。 檢驗量 指供試品一次檢驗的用量。一般為10g或10ml；化學(xué)藥膜劑為100cm2；貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗量改為10g或10ml。 驗證實驗按檢驗量執(zhí)行。,微生物限度檢查樣品,微生物限度檢查樣品,制劑形式多樣，決定前處理各異 難溶固體制劑 非水溶性制劑 軟膏、油膏 栓劑等,供試液的制備 制備供試液所用的乳化劑、分散劑、中和劑及其用量應(yīng)驗證，在該檢驗條件無抗菌作用。 7類供試品供試液的制備，其中增訂：,微生物限度檢查樣品前處理,非水溶性供試

4、品 司盤80、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80 供試品10g，20ml無菌十四烷酸異丙酯和無菌玻璃珠，必要時再加適量十四烷酸異丙酯，充分振搖，使供試品溶解。然后加 45100ml pH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，振搖5-10分鐘，萃取，待油水分層后，取水層作為1：10供試液。,微生物限度檢查樣品前處理,非水溶性膜劑供試品 化學(xué)藥膜劑取100cm2，剪碎，加100ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，浸泡，振搖，作供試液。一部中藥膜劑取50 cm2，剪碎，加適量的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液（50或100ml）浸泡，振搖，以供試品浸液為供試液。（SOP 2000版規(guī)定:中藥膜劑取30-50cm2

5、，剪碎，加水100ml）。,微生物限度檢查樣品前處理,腸溶及結(jié)腸溶制劑 供試品10g，加100ml pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）或pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑）,于45水浴振搖，使溶解。,微生物限度檢查樣品前處理,氣霧劑、噴霧劑供試品 取規(guī)定量供試品，置冷凍室冷凍1h，取出，迅速消毒供試品開啟部位周圍，用無菌鋼錐鉆一小孔，放置室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動容器，使拋射劑全部拋出。以無菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯-80液），使勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成110的供試液。,微生物限度檢查樣品前處理,具抑菌活性的供試品 供試

6、品接種至較大量的培養(yǎng)基中。1ml供試液可等量分注多個平皿；控制菌檢查，可加大增菌培養(yǎng)基的用量，或采用薄膜過濾法。 離心集菌法 薄膜過濾法,微生物限度檢查樣品前處理,微生物限度檢查樣品前處理,目標(biāo)是使不便于取樣的供試品分散均勻！,微生物限度檢查法驗證,細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)方法驗證 定量回收率測定實驗 控制菌檢查方法驗證 定性能否生長、專屬性實驗,在建立供試品的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計數(shù)方法或原法的檢驗條件有改變可能影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對檢查法的可靠性進(jìn)行驗證。驗證時做規(guī)定菌的回收試驗，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實驗方法。,回收率測定實驗,驗證用菌株 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌

7、、白色念株菌、黑曲霉。 菌液制備（同無菌檢查法）。 取培養(yǎng)物用無菌氯化鈉溶液稀釋成1ml含50100cfu的菌液。,回收率測定實驗,驗證方法 試驗組 取規(guī)定量最低稀釋級的供試液，加入50100cfu的菌液，按平板菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)或薄膜過濾計數(shù)。 菌液組 測定加入的試驗菌液的菌數(shù)。 供試品對照組 測定供試品稀釋液（本底）的菌數(shù)。 稀釋劑對照組 取稀釋液加入50100cfu的菌液，按供試品組供試液制備方法和菌落計數(shù)方法測定其菌數(shù)。 驗證試驗應(yīng)獨立平行進(jìn)行3次，分別計算各次 試驗菌的回收率。,回收率測定實驗,回收率計算 試驗組的菌回收率=（試驗組平均菌落數(shù)供試品對照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌

8、落數(shù) 100% 稀釋劑對照組的菌回收率=（稀釋劑對照組的平均 菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）100%,回收率測定實驗,結(jié)果判斷 稀釋劑對照組的菌回收率應(yīng)大于70%。若試驗組的菌回收率均大于70%，符合驗證試驗，可按此方法測定細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次平行試驗中供試品組的菌回收率均小于70%，不符合驗證試驗，應(yīng)建立新的檢驗方法，并重新驗證。 驗證試驗可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計數(shù)同 時進(jìn)行。,回收率測定實驗,回收率測定實驗,常規(guī)法（平皿法） 薄膜過濾法,回收率測定實驗,常規(guī)法（平皿法） 在采用培養(yǎng)基稀釋法時，應(yīng)注意避 免在注皿前菌液和供試液直接接觸；,回收率測定實驗,常規(guī)法（平皿法） 稀釋

9、法（0.5ml/皿；0.2ml/皿）每一平皿均應(yīng)加1ml菌液。 培養(yǎng)基稀釋的表示：1:200；1:400；1:1000,回收率測定實驗,薄膜過濾法 菌液檢驗（計數(shù)）應(yīng)與供試液同法處理，也要采用薄膜過濾法。,在建立供試品的控制菌檢查法或原法的檢驗條件有改變可能影響檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對檢查法的可靠性進(jìn)行驗證。驗證時做規(guī)定菌的回收試驗，以判斷供試品是否具有抗菌活性的實驗方法。,控制菌檢查方法驗證,驗證用菌株 ： 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌。 菌液制備（同前）： 用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1ml含10-100cfu。,控制菌檢查方法驗證,驗證方法 試驗組：

10、取規(guī)定量供試液及10100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過濾法時，試驗菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，沖洗后，取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 陰性菌對照組：設(shè)立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的特異性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃色葡萄球菌；驗證銅 綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查法時的陰性對照 菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。,控制菌檢查方法驗證,結(jié)果判定 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；試驗組未檢出試驗菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌

11、法、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消 除供試品的抑菌活性，并重新驗證。 驗證試驗可與供試品的控制菌檢查同 時進(jìn)行。,控制菌檢查方法驗證,控制菌檢查方法驗證,培養(yǎng)基稀釋法 薄膜過濾法 大腸菌群的半定量,實驗器材,微生物限度檢查薄膜過濾器 經(jīng)過無數(shù)次實驗，開發(fā)出了成熟的微生物限度檢查用薄膜濾器。 安全、可靠、方便。 采用75mm濾膜，菌落計數(shù)更清晰。 無需轉(zhuǎn)膜，直接用于控制菌檢查。,75mm薄膜過濾器,75mm薄膜過濾器,驗證實驗的幾個問題,微生物限度檢查法驗證實驗要點 驗證實驗實例,驗證實驗實例,潔 身 泡 沫 劑 供試液制備：取供試品，放置在-40低溫冰柜中冷凍1-2小時，瓶內(nèi)液體

12、凝固取出，在無菌條件下迅速開啟，將內(nèi)容物取出放入無菌的三角燒瓶內(nèi)，等內(nèi)容物完全液化后，取供試液10ml，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨 緩沖液至100ml，制成1:10的供試液。,驗證實驗實例,氧氟沙星凝膠 供試液制備：取供試品10g，加無菌的5氯化鈣溶液10ml充分混合均勻，再加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1:10的供試液備用。,驗證實驗實例,復(fù)方醋酸地塞米松乳膏 供試液制備：取供試品10g，加45的無菌0.1吐溫溶液至100ml，混勻，作為供試液。,驗證實驗實例,雙唑泰軟膠囊栓 稱取樣品10g，加PH7.0氯化鈉-蛋白胨-聚山梨酯80的混和液100ml(水溫為40)

13、至100ml，濃度為1：10供試液。,驗證實驗實例,離心集菌薄膜過濾法 取離心管上清液1ml加入薄膜過濾器中,沖洗300ml/膜,另取1ml上述5種試驗菌株，加入平皿中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20 ml，白色念珠菌和黑曲霉菌玫瑰紅鈉瓊脂20 ml, 待凝固后，再取膜貼于瓊脂平板, 置規(guī)定溫度培養(yǎng) 2472小時觀察結(jié)果，細(xì)菌計數(shù)，測 定回收率。,驗證實驗實例,黃連上清片 取供試品10g，置均質(zhì)器中充分混勻后加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，制成1:10的供試液。,驗證實驗實例富馬酸酮替酚滴鼻液 控制菌 需檢查大腸埃希菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌,驗

14、證實驗實例,西洛他唑緩釋片 按藥典規(guī)定供試液應(yīng)為1：10 但此緩釋片配成1：10供試液時，其粘稠度 過大，不利于吸取供試液，所以將此類藥物配制成1：20供試液。,驗證實驗實例,調(diào)補肺腎膠囊 此藥品中含有動物組織控制菌需做沙門菌的檢查 在驗證試驗中我們發(fā)現(xiàn)此藥品抑制沙門菌，用稀釋法10g加入到1000ml營養(yǎng)肉湯中，陽性菌才生長。,驗證實驗實例玉屏風(fēng)軟膠囊 此藥品軟膠囊中的液體含有一定的油脂，配制1：10的供試液時油脂浮在水面上，不利于取樣，所以在配制供試液時，用45的無菌0.1%聚酸梨酯80溶液。,驗證實驗實例,供試品 供試液10ml(相當(dāng)于供試品1g、1ml) 80 10min 迅速冷卻 | 100ml 0.1%皰肉培養(yǎng)基 3