第四講 RNA生物合成.ppt

1、第四講 RNA的生物合成,1.原核生物mRNA的特征,（1）原核生物mRNA的半衰期短。 （2）許多原核生物mRNA可能以多順?lè)醋拥男问酱嬖凇?后面幾個(gè)順?lè)醋拥姆g起始會(huì)受到其上游順?lè)醋咏Y(jié)構(gòu)的調(diào)控（圖3-19） （3）原核生物mRNA的5端無(wú)帽子結(jié)構(gòu)，3 端沒(méi)有或只有較短的polyA結(jié)構(gòu)。,原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一個(gè)被稱(chēng)為SD序列的保守區(qū)，因?yàn)樵撔蛄信c16S rRNA 3端反向互補(bǔ)，所以被認(rèn)為在核糖體mRNA的結(jié)合過(guò)程中起作用。,四、原核與真核mRNA特征比較,帽子結(jié)構(gòu)有三種,0類(lèi)帽子：m7GpppX，真核單細(xì)胞生物，如；酵母。,1類(lèi)帽子： m7GpppXm , 真核

2、普遍存在。,2類(lèi)帽子： m7GpppXmpYm ，10 15%的真核有此結(jié)構(gòu)。,形成：帽子結(jié)構(gòu)在剪切前已形成。,2.真核生物mRNA特征,（1）5 端存在 帽子結(jié)構(gòu),圖4 25,（2）絕大多數(shù)真核生物3端具有多聚A尾巴形式,mRNApoly(A)+ 示有poly; mRNApoly(A)- 示無(wú)poly,polyA是在polyA合成酶作用下逐個(gè)湊加的。,AAUAAA為poly(A)附加的識(shí)別序列。,poly A的作用：（1）是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式，它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。 （2）可用于cDNA的合成。,RNA加工過(guò)程及其生理功能,五、內(nèi)含子的剪接、編輯、再編碼

3、及化學(xué)修飾,1. RNA中的內(nèi)含子,內(nèi)含子：在RNA原初轉(zhuǎn)錄本中被切除，而最終不表達(dá)的片段。,外顯子：在RNA原初轉(zhuǎn)錄本中剪接中保留并連在一起最終表達(dá)的片段。,部分人類(lèi)基因中內(nèi)含子序列所占的比例分析,基因 長(zhǎng)度/kb 內(nèi)含子數(shù)量 內(nèi)含子所占比例 胰島素 1.4 2 67 -球蛋白 1.4 2 69 血清蛋白 18 13 89 膠原蛋白組分 31 117 71 因子 186 25 95 萎縮性肌強(qiáng)直因子 2400 78 99,RNA加工過(guò)程及其生理功能,不連續(xù)基因： 真核生物在編碼多肽鏈的核苷酸序列中間存在著與氨基酸編碼無(wú)關(guān)的DNA序列，即一個(gè)基因編碼序列被分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段，稱(chēng)為真核生物的

4、不連續(xù)基因。 不連續(xù)基因由外顯子和內(nèi)含子交替排列組成： 外顯子：編碼蛋白質(zhì)的序列。 內(nèi)含子：初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物hnRNA加工產(chǎn)生成熟mRNA時(shí)被切除的間隔序列。,2. RNA剪接,內(nèi)含子的可能功能： 內(nèi)含子通過(guò)啟動(dòng)子、起始位點(diǎn)的堿基配對(duì)，可以阻止或增強(qiáng)RNA聚合酶的作用； 內(nèi)含子具有各種剪接信號(hào)，不同的細(xì)胞可以選擇不同的拼接點(diǎn)，對(duì)外顯子進(jìn)行有選擇地拼接，形成不同的成熟mRNA； 內(nèi)含子也許有自已特定的蛋白質(zhì)編碼。 切除內(nèi)含子的過(guò)程稱(chēng)為RNA的剪接,RNA的三種剪接方式： 自我剪接內(nèi)含子 能夠自發(fā)地進(jìn)行剪接，又分為型內(nèi)含子和型內(nèi)含子兩個(gè)亞類(lèi)。 由蛋白酶參與剪接的內(nèi)含子 主要在tRNA前體中發(fā)現(xiàn)。 由s

5、nRNP參與剪接的內(nèi)含子 存在于絕大多數(shù)真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)基因中。 （什么是“snRNP”？ 在真核生物的細(xì)胞核中，含有大量的小分子RNA，在天然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白粒子形式存在，稱(chēng)為snRNP。）,mRNA前體中的內(nèi)含子的保守序列,（1） GU-AG法則，Chambon法則 多數(shù)細(xì)胞核mRNA前體中內(nèi)含子的5邊界序列為GU，3邊界序列為AG。因此，GU表示供體銜接點(diǎn)的5端，AG代表接納體銜接點(diǎn)的3端。這種保守序列模式稱(chēng)為GU-AG法則，又稱(chēng)為Chambon法則。,（2）外顯子與內(nèi)含子交界處的序列，內(nèi)含子內(nèi)部的部分序列也可能參與內(nèi)含子的剪接。,A/CAG GUPuAGU A Py rich

6、AG G,5,3,5剪接位點(diǎn) 分支點(diǎn) 3剪接位點(diǎn),外顯子 內(nèi)含子 外顯子,圖 脊椎動(dòng)物mRNA前體中常見(jiàn)的內(nèi)含子剪接所必需的保守序列,許多發(fā)生分叉剪接的核mRNA內(nèi)含子3端上游18-50個(gè)核苷酸處，存在一個(gè)序列Py80NPy87Pu75APy95，其中A為百分之百保守。,3.剪接體進(jìn)行的mRNA的剪接 核內(nèi)mRNA原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的剪輯方式可能是最常見(jiàn)的。在這一模式中，RNA的剪輯需要特異性RNA-protein-復(fù)合物small nuclear rebonucleoproteins（snRNP）和small nuclear RNAs（snRNAs）。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有5種snRNAs-U1，U2，U

7、4，U5，U6。,剪切位點(diǎn)特征：,b. 無(wú)互補(bǔ)。,c. 位于內(nèi)含子和外顯子交界處。,d. 以GU開(kāi)始，以AG告終。,a. 是保守序列，有共同的結(jié)構(gòu)基元：5AGGUAAGU。,真核生物 mRNA前體在剪接過(guò)程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開(kāi)了外噗子1，而腺苷酸原來(lái)已有3，5-磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3，5-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3-OH攻擊內(nèi)含子3末端與外顯子2之間的3，5-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來(lái)，此時(shí)外

8、顯子1和外顯子2可以連接起來(lái)（圖）。,核mRNA前體的剪接機(jī)制： U1snRNP結(jié)合于內(nèi)含子的5端； U2snRNP結(jié)合到內(nèi)含子的分支點(diǎn)上； U5snRNP結(jié)合到內(nèi)含子的3端，U4/U6snRNP結(jié)合于U5； U1和U2結(jié)合，形成套索RNA結(jié)構(gòu)； U4釋放，內(nèi)含子左側(cè)切斷，5外顯子作為獨(dú)立片段釋放； 內(nèi)含子的3剪接點(diǎn)切斷，形成套索內(nèi)含子，游離出來(lái)； 5外顯子和3外顯子連接形成成熟mRNA。,U1 snRNP U2 snRNP,U2,內(nèi)含子的變位剪接：在個(gè)體發(fā)育或細(xì)胞分化時(shí)可以有選擇地越過(guò)某些外顯子或某個(gè)剪接點(diǎn)進(jìn)行變位剪接，產(chǎn)生出組織或發(fā)育階段特異性mRNA，稱(chēng)為內(nèi)含子的變位剪接。 例如：果蠅中

9、與性別分化相關(guān)基因的特異性剪接。,果蠅中與性別分化相關(guān)基因產(chǎn)物的特異性剪接過(guò)程,Sxl pre-mRNA,tra pre-mRNA,dsx pre-mRNA,雄性,雌性,SR蛋白, 核酶的發(fā)現(xiàn),最早認(rèn)為RNA的剪接由蛋白質(zhì)（酶）進(jìn)行。,實(shí)驗(yàn)1： 材料， 四膜蟲(chóng),26S rRNA,分析：是否RNA前體中混有某種蛋白？,4. I類(lèi)和II類(lèi)內(nèi)含子的剪接,實(shí)驗(yàn)2：用重組DNA制備RNA前體,重組DNA,RNA前體,26S rRNA,結(jié)論：RNA具有自我剪接能力，稱(chēng)之為Ribozyme.,1986年獲諾貝爾獎(jiǎng), I類(lèi)內(nèi)含子的剪切機(jī)制,剪接反應(yīng)由2個(gè)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)完成（四膜蟲(chóng)、細(xì)菌）。,a. 第一個(gè)轉(zhuǎn)酯反應(yīng)由

10、一個(gè)游離的鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸介導(dǎo)，鳥(niǎo)苷或鳥(niǎo)苷酸3-OH 作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5的磷酸二酯鍵，從上游切開(kāi)RNA鏈。,b. 上游外顯子3-OH 攻擊內(nèi)含子3位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使外顯子1和外顯子2聯(lián)結(jié)。,c. 釋放內(nèi)含子環(huán)。,Group I內(nèi)含子切除體系, II類(lèi)內(nèi)含子的剪切機(jī)制,細(xì)胞內(nèi)定位：存在于真核生物的線粒體和葉綠體rRNA基因中,特點(diǎn)：轉(zhuǎn)酯反應(yīng)無(wú)需游離鳥(niǎo)苷酸或鳥(niǎo)苷。 過(guò)程： a. 由內(nèi)含子本身的靠近3端的腺苷酸2 -OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子5 端的磷酸二酯鍵，從上游切開(kāi)RNA鏈后形成套索結(jié)構(gòu)。 b. 再由上游外顯子的自由3 OH作為親核基團(tuán)攻擊內(nèi)含子3 位核苷酸上的磷酸二酯鍵，使內(nèi)含子被

11、完全切開(kāi)。 c. 上下兩個(gè)外顯子通過(guò)磷酸二酯鍵相連。,Group II內(nèi)含子切除體系, 剪切位點(diǎn)突變導(dǎo)致地中海貧血癥（thalassemia),地中海貧血癥起因于血紅蛋白合成缺陷。,此類(lèi)貧血癥中有一類(lèi)是異常剪接引起。,mRNA前體中的內(nèi)含子（intron)必須精確的剪切掉，剪切位置發(fā)生一個(gè)核苷酸的差異，即會(huì)導(dǎo)致閱讀框（reading frame)的改變，從而合成非功能蛋白。,-珠蛋白的第一內(nèi)含子發(fā)生突變，突變位點(diǎn)發(fā)生在正常3剪接位點(diǎn)上游，離位點(diǎn)20個(gè)N處。 正常人是G，病人是A，即G A。從而導(dǎo)致產(chǎn)生了一個(gè)新的3剪接位點(diǎn)（原位點(diǎn)上游），新剪切位點(diǎn)剪切，使mRNA中密碼子變化。在新剪切點(diǎn)后的第7

12、個(gè)密碼子是蛋白質(zhì)合成的終止密碼。結(jié)果是合成不正常的血紅蛋白-亞基，導(dǎo)致貧血癥。,核酶發(fā)現(xiàn)的意義,生命的最初形式可能是RNA，其兼有DNA和蛋白質(zhì)的功能。 在進(jìn)化過(guò)程中 作為遺傳模板的功能讓位于DNA（RNA不穩(wěn)定） 作為催化劑的功能讓位于蛋白質(zhì)。 c. 利用其機(jī)制，設(shè)計(jì)合成特異性切割病毒RNA或其它RNA的核酶，以便于治療包括愛(ài)滋病、癌癥在內(nèi)的疾病。, 核酶的類(lèi)型： a.剪切型 b.剪接型,2. RNA的編輯、再編碼及化學(xué)修飾,（1） RNA的編輯,RNA的編輯是某些mRNA前體的一種加工方式，如插入、刪除或取代一些核苷酸殘基，導(dǎo)致DNA所編碼的遺傳信息的改變，因?yàn)榻?jīng)過(guò)編輯的mRNA序列發(fā)生了

13、不同于模板DNA的變化。,類(lèi)型,位點(diǎn)特異性脫氨基作用 引導(dǎo)RNA指導(dǎo)的尿嘧啶插入或刪除,哺乳動(dòng)物載脂蛋白mRNA的編輯,CAA,UAA,肝中剪接的mRNA編碼含4563個(gè)殘基的蛋白質(zhì),腸中mRNA有密碼子在第2153位密碼子終止合成,第2153位密碼子編碼Gln,CAA,哺乳動(dòng)物中RNA編輯的實(shí)例,利什曼原蟲(chóng)屬細(xì)胞色素b mRNA的編輯,AAAUAUAAUAGAA,A G G C,AAA UAUAA UAGAA,UUUAUGUUGUCUU,與指導(dǎo)RNA配對(duì),U插入,釋出mRNA,UUUAUGUUGUCUU,指導(dǎo)RNA,mRNA,mRNA,RNA編輯的生物學(xué)意義,（1）校正作用 （2）調(diào)控翻譯

14、（3）擴(kuò)充遺傳信息,2. RNA的再編碼,mRNA在某些情況下不是以固定的方式翻譯，而是可以改變?cè)瓉?lái)的編碼信息，以不同的方式進(jìn)行翻譯，科學(xué)上把RNA編碼和讀碼方式的改變稱(chēng)為RNA的再編碼。,核糖體1/-1移位 核糖體跳躍 終止子通讀,3.RNA的化學(xué)修飾,有些RNA，特別是rRNA和tRNA，還可能有特異性化學(xué)修飾。圖3-35 例如：人細(xì)胞內(nèi)rRNA分子就存在106種甲基化和95種假尿嘧啶產(chǎn)物。,rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工,真核生物有4種rRNA。,大亞基（60S）rRNA: 28S(4700nt); 5S(120nt); 5.8S(160nt)。,小亞基（40S）rRNA ： 18S（1900nt)。,其中5.8S rRNA 、18S rRNA 、28 S rRNA 為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，前體為45S RNA，其加工過(guò)程如圖。,5S rRNA與tRNA在一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位中。,六、rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工,4-30,轉(zhuǎn)錄后加工步驟：, 切除成熟 tRNA 5、3序列：,5- ：RNaseP。,3 ：核酸內(nèi)切酶和外切酶。, 3-末端CCA湊加：