靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù)PPT參考課件

1、靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù) 幫助臨床醫(yī)生更全面地評(píng)估肺癌,1,2020/8/31,Lung Cancer in Solid Tumor in China,2,2020/8/31,=,？,液態(tài)活檢 通過外周血中的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤基因組信息來評(píng)估腫瘤,病理活檢 通過原發(fā)灶腫瘤組織來評(píng)估腫瘤,CTC ctDNA mircoRNA LNC RNA Others,傳統(tǒng)的組織細(xì)胞學(xué)檢測(cè),液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用,治療策略,事件,疑似肺癌,輔助診斷,早癌肺癌,晚期肺癌,癌癥耐藥,復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè),治療方案選擇,耐藥機(jī)理 新藥研發(fā),CTC的臨床應(yīng)用價(jià)值,療效評(píng)估,CTC(數(shù)量） (負(fù)向富集+靶向PCR）,ctDNA (

2、基因變異）,5,2020/8/31,1、K. Pantel, et al. Nat Rev Clin Oncol, 2009;2、K. Pantel and MR. Speicher, Oncogene 2015,什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell，CTC）？,腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài),CTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞和不具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell）CTC1,CTC有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC

3、（disseminated Tumor Cell），只有由具有干細(xì)胞特征的DTC所形成的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識(shí)別才可能發(fā)展成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2,什么時(shí)候可以檢測(cè)到CTC？,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,W He, et al. Proc Natl Acad Sci, 2007,早期腫瘤外周血中即可檢出CTC,表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面 移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測(cè)到大約1.4個(gè)CTC細(xì)胞 移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測(cè)7個(gè)和18個(gè)CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升 在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)

4、現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象,CTC富集技術(shù) 密度與大小 免疫磁珠（負(fù)向富集 or 陽性富集) 微流體,CTC檢測(cè)方法,CTC檢測(cè)技術(shù) 靶向PCR 免疫熒光 普通PCR,=,+,“方法”,“收獲”,“垃圾”,蟹餌,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負(fù)向富集,優(yōu)勢(shì)：回收率100% 劣勢(shì)：純度略低,幸好沒貪嘴， 我們逃了,10,2020/8/31,“方法”,“收獲”,“垃圾”,沒水了， 我們躲不了了,放 水,負(fù)向富集,優(yōu)勢(shì)：回收率100% 劣勢(shì)：純度略低,幸好沒吃胖， 我們逃了,網(wǎng) 篩,11,2020/8/31,CTC檢測(cè)技術(shù) 檢測(cè)原理,負(fù)向富集,靶向PCR,FR陽性靶標(biāo),肺癌細(xì)胞FR(葉酸受體）高度表

5、達(dá) CTC：FR=1:50萬 EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度 其他血細(xì)胞不表達(dá)FR,CTC回收率接近100% 磁珠富集易操作和自動(dòng)化,靈敏度超高，負(fù)向富集可滿足檢測(cè)要求 信號(hào)二次放大，1個(gè)CTC信號(hào)放大1012倍 無需人工經(jīng)驗(yàn)判讀，結(jié)果客觀準(zhǔn)確 可實(shí)現(xiàn)CTC的定量,12,2020/8/31,CTC檢測(cè)靶向PCR，信號(hào)放大，保證高度敏感性,1個(gè)CTC信號(hào)放大1012倍,13,2020/8/31,CTC檢測(cè),優(yōu)勢(shì)一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細(xì)胞,優(yōu)勢(shì)二：靶向探針特異性高,優(yōu)勢(shì)三：PCR擴(kuò)增信號(hào)，確保高敏感性,優(yōu)勢(shì)四：PCR儀判斷CTC技術(shù)，避免人為誤差,14,2020/8/31,3mL血,1mL/3mL血

6、,3mL血,1個(gè)CTC/3mL血,50萬FR/1個(gè)CTC,1個(gè)CTC/1slide,100萬信號(hào)/1個(gè)FR,1個(gè)信號(hào)/1個(gè)CTC,FR靶向PCR 1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)方法1012倍（萬億倍）,細(xì)胞免疫熒光 1個(gè)CTC細(xì)胞信號(hào)幾乎沒有放大,15,2020/8/31,Cell Search:正向富集+免疫熒光技術(shù)進(jìn)行捕獲和鑒定,16,EpCAM 上皮細(xì)胞粘附分子 APC 異藻藍(lán)蛋白熒光染料 CK 細(xì)胞角蛋白 PE 藻紅蛋白熒光染料 DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）,2020/8/31,EpCAM陰性細(xì)胞中，存在大量CTC,Cell Research系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮

7、粘附分子）做為探針 研究證實(shí)，EpCAM陰性的細(xì)胞中也存在CTC,Jiatao Lou, et al. Plos One 2013,17,2020/8/31,2004,Cell Search: 乳腺癌中檢測(cè)出，但肺癌敏感性低,2011,Cell Research: 采用的抗體(EpCAM)對(duì)EMT細(xì)胞特異性差，而肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過程,19,2020/8/31,3mL血6個(gè)小時(shí)得到報(bào)告,檢測(cè)流程,20,2020/8/31,肺癌領(lǐng)域，CTC檢測(cè)技術(shù)對(duì)比,不同CTC計(jì)數(shù)對(duì)于肺癌診斷的特異性與敏感性,22,2020/8/31,CTC對(duì)肺癌的診斷顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物,CTC與一般腫瘤標(biāo)志物

8、對(duì)肺癌診斷的準(zhǔn)確性（AUC值）,23,2020/8/31,單項(xiàng)CTC檢測(cè)的輔助診斷價(jià)值優(yōu)于多個(gè)一般腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合,AUC=0.91, P0.0001,AUC=0.76,24,2020/8/31,不同病理類型中，CTC輔助診斷價(jià)值均優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物,25,2020/8/31,CTC肺癌輔助診斷小結(jié),CTC反應(yīng)肺癌發(fā)生發(fā)展功能狀態(tài)，肺癌輔助診斷價(jià)值顯著優(yōu)于一般腫瘤標(biāo)志物 靶向PCR CTC技術(shù)：所有肺癌敏感性提高3倍，I期肺癌提高10倍,26,2020/8/31,CTC：用于化療療效評(píng)估，先于腫瘤大小發(fā)生變化，評(píng)估腫瘤功能狀態(tài),NSCLC, 1st-line carboplatin, pacli

9、taxel (d); NSCLC, 2nd-line pemetrexed(e) Baseline CT scans were before therapy initiation and CTC measurements began at or shortly after the first treatment.,27,2020/8/31,CTC數(shù)量變化與RECIST標(biāo)準(zhǔn)基本一致,28,2020/8/31,FR靶向PCR CTC檢測(cè)與肺腺癌患者一線培美曲塞化療療效相關(guān),培美曲塞是一種抗葉酸制劑，通過破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴性的正常代謝過程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng) FR靶向PCR CTC檢測(cè)

10、技術(shù)特異性檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體含量 研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，接受一線培美曲塞化療的肺腺癌患者治療前CTC水平越高，ORR與PFS越好 葉酸受體表達(dá)量與培美曲塞治療效果正相關(guān),29,2020/8/31,Cut off為16cu/3ml, 高表達(dá)患者的ORR明顯優(yōu)于低表達(dá)者,CTC16: 8/12（75%）患者PR，DCR 100% 8.7CTC16: 1/9（11%）患者PR,30,2020/8/31,CTC16: PFS 448天 8.7CTC16: PFS 94天,Cut off為16cu/3ml, 高表達(dá)患者的PFS明顯優(yōu)于低表達(dá)者,31,2020/8/31,總結(jié),靶向PCR CTC檢測(cè)技術(shù)敏感度最高，反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)，可做為新