細胞凋亡及其調(diào)控分子機制

1、細胞凋亡及其調(diào)控分子機制,凋亡的概念，與壞死的區(qū)別 凋亡信號通路 細胞凋亡相關(guān)蛋白、細胞凋亡與疾病 細胞凋亡檢測,細胞凋亡名稱的由來,英國Aberdeen大學(xué)病理系 Kerr教授,1972年我和Wyllie在研究中觀察到一種不同于壞死的細胞死亡方式，聯(lián)想到秋日落葉，我們 就把它稱作 Apoptosis,Sydney Brenner 1/3 of the prize United Kingdom The Molecular Sciences Institute Berkeley, CA, USA b. 1927(in Union of South Africa),H. Robert Horvit

2、 1/3 of the prize USA Massachusetts Institute of Technology (MIT) Cambridge, MA, USA b. 1947,John E. Sulston United Kingdom The Wellcome Trust Sanger Institute Cambridge, United Kingdom b. 1942,THE 2002 NOBEL PRIZE WINNER,王曉東：,從事的是細胞凋亡規(guī)律的研究。2000年，他和助手們進行了一項實驗，研究一種神秘的線粒體蛋白質(zhì)Smac，這種蛋白質(zhì)可以打破腫瘤的“堅硬堡壘”，誘使腫

3、瘤細胞“自殺”，對研究治療癌癥方法有重要幫助。從1996年他建立起自己的研究室后，他的論文成果在8年間被其他科學(xué)家引用超過了15000次。,第一節(jié) 細胞凋亡的特征及意義,一、細胞凋亡的基本特征,程序性細胞死亡programmed cell death, PCD在發(fā)育過程中定時出現(xiàn)的生理性刺激誘導(dǎo)的細胞死亡。用于選擇性地清除多細胞動物體內(nèi)一些無用的或危險的細胞。 依據(jù)形態(tài)學(xué)不同，程序性細胞死亡可劃分為凋亡（apoptosis）、自噬（autophagy）、腫脹性死亡3種形式。 細胞凋亡：apoptosis 在生理和病理條件下，由基因控制的自主有序的死亡過程。 生理條件下，凋亡用以清除單個細胞，繼

4、而由巨噬細胞內(nèi)吞，最后再由溶酶體執(zhí)行降解功能。 自噬autophagy:是一種在進化上保守的真核細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運泡的運輸機制，它可將細胞本身的亞細胞成分如蛋白、胞質(zhì)或細胞器，通過溶酶體中的水解酶進行消化降解和循環(huán)。 凋亡和自噬都是細胞內(nèi)重要的生理過程。 壞死Necrosis ：各種致病因子，干擾和中和了細胞的正常代謝活動，造成細胞的意外死亡。,誘發(fā)因素 特定的生理病理因素，藥物 缺氧、藥物、毒素 組織分布 單個細胞分布 成片細胞 組織反應(yīng) 形成凋亡小體，被周圍組織 細胞內(nèi)容物溶解 細胞吞噬，無炎癥反應(yīng) 釋放，有炎癥反應(yīng),壞死,凋亡,形態(tài)學(xué)：,細胞體積 皺縮變圓，細胞漿失水濃縮 腫脹，外形不 規(guī)則化

5、細胞膜 保持完整，形成泡狀，凋亡 破裂 后期內(nèi)陷包裹核物質(zhì)和細胞器 形成凋亡小體 細胞核 核膜完整，核皺縮，染色質(zhì)固縮 核腫脹破裂， 聚集在核膜下，最后核裂成碎片 染色質(zhì)不規(guī) 則外移 細胞器 大多數(shù)保持完整，線粒體腫脹， 多受損，溶 通透性增加，釋放細胞色素 酶體破裂，線 粒體腫脹破裂,凋亡,壞死,DNA 階梯狀片段化 隨機斷裂 磷脂 凋亡早期磷脂酰絲氨酸外翻 外翻 ATP 合成并提供能量 耗竭,凋亡,壞死,生物化學(xué)：,出現(xiàn)180-200bp大小及其倍數(shù)的核苷酸片段，DNA LADDER,細胞壞死與凋亡的形態(tài)區(qū)別,細胞凋亡的誘發(fā)因素,細胞凋亡的生理意義,1、 確保正常發(fā)育、生長，根據(jù)代謝需要調(diào)

6、節(jié)細胞數(shù)量、保持成體器官正常體積。 如：指（趾）間隙的形成 2、 維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 如：清除受損、突變或衰老的細胞 3、 防御功能 如：使受到病毒感染的細胞凋亡,第二節(jié) 細胞凋亡的發(fā)生機制,一、 凋亡相關(guān)基因 （一）ced 基因 線蟲（c. elegans），1090個體細胞，其中131個細胞在發(fā)育過程中產(chǎn)生凋亡，發(fā)現(xiàn)14個基因與凋亡有關(guān)；且蟲體透明，易于觀察。,細胞內(nèi)與凋亡有關(guān)的基因分2類：,1存活基因：ced-9： bcl-2蛋白家族 2致死基因：ced-4： 凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1, apoptosis protease activating factor-1, 3. 致死基因：c

7、ed-3： Caspase 家族 (cycteinyl aspartate-specific protease).天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶,線蟲,人類,Caspase：,1996 年 Alnemri 等統(tǒng)一命名的一類與ICE/Ced-3 同源性半胱氨酸蛋白酶。,（二）caspase 與細胞凋亡,1.特點： (1) 是一種Cys 蛋白酶 (2) 底物Asp-X (3) 以酶原形式存在 (4) 活化的Caspase 特異性水解一套底物，導(dǎo)致不可逆的細胞凋亡 (5) 細胞內(nèi)有Caspase抑制劑。 IAP, inhibitors of apoptosis proteins,2. 結(jié)構(gòu)特征,以無活

8、性的形式存在。 在Pro-Caspases的N端均含有一段的前區(qū)域（Prodomain）。 活性形式均是由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體。 一分子Pro-Caspase只能分裂產(chǎn)生1個大亞基和1個小亞基 。 大亞基的C端含有活性中心，其中半胱氨酸（C）是必需氨基酸，故屬于半胱氨酸蛋白酶類。,3. 分類：14種 （1）細胞因子前體： caspase 1，4，5， 11，12，13，14 不是凋亡的直接效應(yīng)分子。 （2）凋亡起始分子： caspase 2，8，9，10 （3）凋亡效應(yīng)分子： caspase 3，6，7 參與介導(dǎo)細胞凋亡。,ICE家族成員 A：3類caspase：藍色參與炎癥反

9、應(yīng)，紅色為執(zhí)行者，綠色為啟動者；B：caspase-3的結(jié)構(gòu)模型；C：caspase-3的活化過程,執(zhí)行者,啟動者,4. caspase活化： Caspase 酶原有很低的活性 若caspase 過表達，酶原在高濃度下可自身活化 Caspase 8，9 含有死亡效應(yīng)域（death effect domain , DED），可相互作用，使酶原自身活化。 Caspase 8：激活所有酶原,如:Caspase 3,6,7,9 Caspase 9：活化需線粒體釋放Cyt C, 活化后激 活Caspase2, 3,6,8,10。 Caspase 3,6,7: 效應(yīng) Caspase 。,5. Caspas

10、e 作用：,（1）滅活細胞凋亡抑制蛋白: 鼠: Caspase活化的DNA酶: Caspase activated deoxyribonuclease, CAD， 細胞凋亡抑制物：inhibitor of CAD, ICAD ICAD與CAD結(jié)合，CAD無活性， Caspase剪切ICAD，ICAD失活，CAD活化， CAD游離，進入細胞核內(nèi)降解DNA。 人：Hela cell，DFF（DNA fragment factor) ，與ICAD同源,Ca2+/Mg2+ 依賴的核酸內(nèi)切酶： 多聚ADP-核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase, PARP）抑制Ca2+/Mg2

11、+依賴的核酸內(nèi)切酶,與基因完整性的監(jiān)護有關(guān)。 PARP降解， Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶活性增加，裂解核小體間的DNA，導(dǎo)致細胞凋亡。,Caspase,（2） 降解細胞結(jié)構(gòu)蛋白： 降解核纖層蛋白，肌動蛋白，核分裂相關(guān)蛋白,(3)切割細胞效應(yīng)蛋白。,(4)降解其他的caspases,6 . Caspase活化抑制劑 IAP, inhibitors of apoptosis proteins 細胞內(nèi)存在的Caspase抑制蛋白，IAP inhibitors of apoptosis proteins家族，阻止細胞凋亡過程。,二、細胞凋亡的誘導(dǎo)發(fā)生 細胞凋亡的信號傳遞 （1）Fas介導(dǎo)細胞凋

12、亡 （2）細胞色素C介導(dǎo)的細胞凋亡 （3）粒酶GrB誘導(dǎo)細胞凋亡,1,2,DR：死亡受體 death receptors, DR 含DD：死亡結(jié)構(gòu)域，death domain, DD （DD存在于DR之胞內(nèi)區(qū)，和FADD蛋白中） FADD蛋白：Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)as-associated death domain （FADD蛋白含有DD，DED；可與pro-caspase 8結(jié)合） DED：死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域，death effecter domain, DED （存在于FADD蛋白、一些起始caspase酶原如pro-caspase 8中）,（1）死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡（外源性的）,Fa

13、s-細胞表面受體，跨膜蛋白；,共4個蛋白,1. Fas Ligand（FasL） 是Fas 的天然配體，兩者介導(dǎo)細胞凋亡，F(xiàn)as L主要在淋巴細胞膜上表達。,2. Fas Fas /Apo-1存在于細胞表面的特定區(qū)域，一旦被Fas L或Fas抗體激活，可將信號傳遞到細胞內(nèi)。 Fas 屬腫瘤壞死因子受體(TNFR)及神經(jīng)生長因子受體（NGFR）超家族，是細胞凋亡的受體信號，又叫死亡分子。,Fas/Apo-1 (CD95),Fas 從人KT3細胞株分離的cDNA克隆。 Apo-1從人SKW6.4細胞株分離的cDNA克隆。 后來證明兩者完全一致，命名為Fas/Apo-1，或稱CD95。 Fas蛋白位

14、于10q33，編碼335AA，成熟319AA，是跨膜蛋白。 由胞外區(qū)，跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)組成。 胞內(nèi)區(qū)有80AA,稱死亡結(jié)構(gòu)域（death domain, DD）,3. FADD蛋白: Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白：Fas-associated death domain protein 包括：DD ，死亡結(jié)構(gòu)域 death domain DED ，死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域 death effect domain,Death inducing signal comples, DISC,Fas L與Fas 結(jié)合(同三聚體) Fas 的DD成簇，與FADD蛋白結(jié)合， FADD 蛋白活化 Caspase 8活化 Cas

15、pase 3，6，7活化 細胞凋亡,（1）Fas介導(dǎo)細胞凋亡,死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物 Death inducing signal complex, DISC,誘導(dǎo)因素跨膜電位（ m） PTP開放（通透性轉(zhuǎn)換孔） 凋亡啟動因子（細胞色素C，smac，AIF）釋出 AIF：凋亡誘導(dǎo)因子,（2）線粒體相關(guān)的細胞凋亡途徑（內(nèi)源性的）,現(xiàn)在，提得最多的、比較公認的線粒體在凋亡中的作用有兩點： （1）細胞色素C的釋放； （2）Smac/Diablo 的釋放。,（2）細胞色素C介導(dǎo)的細胞凋亡,Cyt C 釋放入胞質(zhì) 與胞漿接頭蛋白Apaf-1結(jié)合 Apaf-1寡聚化，募集Caspase 9原 Caspase 9

16、 活化 Caspase 2,3,6,8,10 活化 細胞凋亡,凋亡蛋白酶激活因子1，Apoptotic protease activating factor-1,Caspase recuitment domain,5 Fas介導(dǎo)細胞凋亡,Caspase 8活化,凋亡誘導(dǎo)因子,凋亡蛋白酶 激活因子,EndoG:endonuclease G 核酸內(nèi)切酶G AIF：Apoptosis inducing factors Apaf-1:Apoptotic protease activating factor-1,線粒體仍有足夠的Cyt C，及其他細胞色素，呼吸鏈完整，產(chǎn)生ATP，保證 Caspase 活

17、化，細胞凋亡。 Cyt C釋放過多，呼吸鏈破壞，氧消耗，但是不產(chǎn)生ATP，導(dǎo)致細胞壞死。 細胞含有caspase抑制劑，不能導(dǎo)致caspase依賴的細胞凋亡；,當(dāng)線粒體巨通道破壞，Cyt C釋放：,AKt JNK p53,Bcl-2,（3）粒酶的基本結(jié)構(gòu)和功能 定義：粒酶，Granzyme，Gr，是CTL和NK細胞殺傷性顆粒中絲氨酸蛋白酶家族的總稱，以酶原形式存在。 分類：GrA, GrB, GrH, GrM, 類胰蛋白酶2 功能：酶切靶細胞的多種底物蛋白，啟動細胞凋亡。 GrB活性最高，與其他粒酶，穿孔素（PEN, Perforin）一起儲存在CTL的殺傷顆粒中。,粒酶進入靶細胞：,CTL識

18、別靶細胞，殺傷性顆粒移向靶細胞一極（極化） GrB, PEN 等蛋白釋放入細胞間隙 穿孔素(PEN) 協(xié)助GrB 進入靶細胞，定位在胞漿和胞核,CTL,腫瘤細胞,CTL正在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,GrB誘導(dǎo)細胞凋亡,（1） Caspase依賴途徑： GrB 切割 Caspase 10 Caspase 3, 7, PARP(多聚ADP核糖聚合酶)，Bid，DNA片段化因子(DFF) 細胞凋亡 GrB確保靶細胞即使缺失1種或幾種Caspase成員時，仍能走向凋亡。,切割 DFF，使CAD游離，降解DNA 結(jié)構(gòu)蛋白Filamin，使細胞骨架破壞 PARP，使Ca2+/Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶活性增加，裂解

19、核小體間的DNA 細胞凋亡,GrB,DFF：DNA片段化因子 CAD：caspase活化DNA酶 PARP：多聚ADP-核糖聚合酶,人：Hela cell，DFF（DNA fragment factor) ，與 ICAD同源,（2）GrB介導(dǎo)線粒體凋亡途徑, GrB 切割胞漿Bid，產(chǎn)生活化Bid（tBid） tBid移至線粒體，募集Bax， 誘導(dǎo)線粒體釋放Cyt C，Smac等因子， 細胞凋亡, 誘導(dǎo)線粒體開啟膜通透性孔道PTP， 破壞線粒體內(nèi)膜電位，損傷線粒體功能，導(dǎo)致細胞死亡。,第三節(jié) 細胞凋亡的調(diào)控,細胞自身蛋白的調(diào)控作用 （一）P53 （二）Bcl-2家族蛋白 （三）c-myc （四

20、）IAP家族蛋白,細胞凋亡的相關(guān)調(diào)控基因,抑制凋亡基因：Bcl-2、IAPs 促進凋亡基因: Fas 、Bax、P53、 雙向調(diào)控基因: c-myc,(一) P53,野生型的P53蛋白是一種包含393AA的轉(zhuǎn)錄因子，活性形式為四聚體，自N端起依次包括轉(zhuǎn)錄活化區(qū)，DNA結(jié)合區(qū)，四聚體化區(qū)，C端調(diào)節(jié)區(qū)。 1. P53表達 細胞中的DNA損傷，紡錘絲斷裂，癌基因異常激活，缺氧，ATP儲備下降等信號都能導(dǎo)致p53表達增加。 已發(fā)現(xiàn)有數(shù)十種p53的相互作用蛋白，P53在胞漿中的含量受到嚴密的監(jiān)控。,2. P53對細胞周期和凋亡的調(diào)節(jié),（1）抑制細胞周期 p53主要作用于細胞周期的G1/S期，G2/M期等

21、檢查點，并引起細胞周期停滯于G1或G2期。 p53通過促進p21的表達，抑制如cyclinD-CDK4, cyclinE-CDK2等的活性，引起細胞周期阻滯于G1期。 細胞周期負調(diào)節(jié)因子14-3-3sigma是p53下游靶基因之一，主要通過調(diào)節(jié)細胞周期的G2/M檢查點引起G2期阻滯，且與p21有相互增強作用。,（2） 促進細胞凋亡,細胞周期在G1，G2/M期的停滯為細胞DNA修復(fù)提供了時間，一旦修復(fù)失敗，p53則在其他因素作用下，有效誘導(dǎo)細胞凋亡。 P53促進一系列細胞凋亡的相關(guān)分子的表達如Fas，DR5，Bax，Apaf-1，Noxa， PUMA 等，增加細胞對凋亡信號的敏感性。,P53 :

22、 molecular policeman?,（二）Bcl-2家族蛋白的調(diào)控作用,（1）Bcl-2家族的結(jié)構(gòu) Bcl-2 B cell lymphoma/leukemia-2 兩個結(jié)構(gòu)域： 羧基端的跨膜結(jié)構(gòu)域 Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（Bcl-2 homology, BH） Bcl-2 229aa構(gòu)成，分布在線粒體內(nèi)膜，細胞內(nèi)膜表面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核膜等處 Bcl-2 和C. elegans 中的ced-9 有很高的同源性，具有促進細胞存活的功能 Bcl-2的功能是延長細胞的壽命，而不是刺激細胞的增殖,Bcl-2家族分子結(jié)構(gòu),(2) BcL-2的同源基因和蛋白質(zhì),抗凋亡作用， 促凋亡作用，有Bax，Bak

23、, BH3 only protein: BcL-2基因家族成員自身或彼此之間有形成二聚體或多聚體的能力，BcL-2家族的蛋白與蛋白相互作用調(diào)節(jié)著細胞的存活與凋亡。,Bcl-2, Bax, Bcl-xs對凋亡的作用：,因此，Bcl-2表達增加，并不一定抑制凋亡,（1）Bax/Bax形成二聚體，誘導(dǎo)凋亡 （2）Bcl-2/Bax二聚體更穩(wěn)定，Bcl-2增加， Bcl-2/Bax增加，Bax/Bax減少，抗凋亡。 （3）Bcl-xs存在，與Bcl-2形成二聚體，Bcl-2/Bax減 少，Bax/Bax增加，誘導(dǎo)凋亡,(3) Bcl-2抗凋亡機制,直接的抗氧化 抑制線粒體釋放促凋亡的蛋白質(zhì) 抑制促凋亡

24、的Bax，Bak的作用 抑制Caspases激活 維持細胞鈣穩(wěn)態(tài),（三）c-myc,8q24，編碼產(chǎn)物p62，在核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄因子活性，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。 功能：促進細胞增殖。 c-myc 低水平時，細胞生長停滯。 c-myc表達，血清生長因子存在時，促進細胞增殖。 c-myc表達，血清生長因子不存在時，促進細胞凋亡。 幾乎所有腫瘤都有c-myc 基因的異常表達（高表達）。,（四）IAP家族蛋白,IAP (inhibitor of apoptosis proteins) 家族蛋白是細胞凋亡抑制蛋白家族，已發(fā)現(xiàn)8個IAP家族成員，NIAP, cIAP-1, cIAP-2，XIAP, survivin

25、, BRUCE, livin, ILP-2,（1）IAP直接抑制Caspase途徑的caspase 3，7，9的活性。 如在Fas/caspase 8 途徑中，IAP抑制caspase 3 活性而發(fā)揮抑制。 在Cyt C/Apaf-1途徑中， XIAP直接與caspase 9 酶原結(jié)合，抑制caspase 9 活化；又結(jié)合caspase 3，抑制caspase 3 作用。 （2）作用于TNFR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，抑制細胞凋亡。,作用：,第五節(jié) 細胞凋亡與疾病,細胞增殖過快及凋亡過少均在腫瘤的發(fā)生中起了重要作用,P53突變，Bcl-2的高表達在許多腫瘤中都存在,Carcinogens Mutat

26、e p53,Bladder Blood Brain Breast Colon Esophagus Liver Lung Spleen Thyroid,Cancer Types,Chemicals Viruses Radiation,Mutate,正常機體細胞生長與死亡的平衡,生長,壞死、凋亡,正常機體,細胞凋亡與疾病,凋 亡 相 對 不 足,腫瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等,腫瘤 腫瘤的重要發(fā)病機制: 細胞增殖過度 細胞凋亡受抑、死亡不足 病變組織內(nèi)細胞存活 死亡, 腫瘤細胞數(shù)目的凈增長加大 可能機制：Bcl-2高表達、IAPs高表達，P53基因突變 從發(fā)病學(xué)上，細胞凋亡實際是機體天然的抗癌機

27、制之一,細 胞 凋 亡 過 度,神經(jīng)退行性疾病、造血衰竭性疾病、 心肌缺血/再灌注損傷,心血管疾病 心肌缺血、缺血-再灌傷所致心肌細胞死亡： 壞死和凋亡 可能機制：氧化應(yīng)激、鈣超載、p53基因激活 心肌細胞凋亡造成心肌細胞數(shù)量減少也可能是心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的主要原因之一,細 胞 凋 亡 過 度,第四節(jié) 細胞凋亡的檢測方法,一、形態(tài)學(xué)檢測 （一） HE染色 （二）透射電鏡觀察 （三）熒光顯微鏡觀察,透射電鏡觀察,凋亡早期，染色體核邊集，在核膜周圍邊聚形成新月體形，隨之染色體發(fā)生固縮，呈電子密度增強，核形不規(guī)則。 核膜表面凹凸不平，核發(fā)生碎裂。 細胞體積變小，細胞漿濃縮，其內(nèi)的細胞器保存較好，或輕

28、度增生。 線粒體數(shù)目輕度增加和輕度腫脹，細胞漿可見空泡增多，細胞膜保持完整。 細胞膜表面微茸毛和偽足減少或消失。 凋亡晚期，可見膜包裹內(nèi)有較完整細胞器和細胞核碎片的凋亡小體。,apoptosis,概 述,熒光顯微鏡觀察 fluorescent microscope,Hoechst33258, Hoechst33342,均為DNA特異性染料，與AT鍵結(jié)合，在pH2.0時優(yōu)先與RNA結(jié)合，染色DNA時應(yīng)調(diào)pH7.0。 染料不溶于磷酸緩沖液，所以配制時先必須用蒸餾水溶解，4避光保存。 染料對死細胞或70冷乙醇處理的細胞可立即染色，對活細胞的染色是漸進的，在10min內(nèi)可達到飽和。,二、生化檢測,（一

29、）瓊脂糖凝膠電泳（二）原位末端標記技術(shù),（一）瓊脂糖凝膠電泳,原理：染色體從核小體間斷裂，為180200bp或其倍數(shù)組成的寡核苷酸片段。 通過提取DNA，電泳，UV下，可見DNA Ladder。 觀察：凋亡細胞 Ladder 壞死細胞 Smear,操作： 收集細胞，PBS洗滌 細胞裂解液 酚抽提 氯仿異戊醇抽提 無水乙醇沉淀 TE溶解 電泳 觀察,觀察：凋亡細胞 Ladder 壞死細胞 Smear,（二）原位末端標記技術(shù),原位末端標記是： 將滲入到凋亡細胞的外源性核苷酸（生物素標或熒光標）在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的作用下，與斷裂的ssDNA或dsDNA聚合，再通過顯色系統(tǒng)顯示。 通常的方法是：末

30、端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記（terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick endlabeling,稱TUNEL）,常用的標記和顯色系統(tǒng)： 生物素標記的dUTP 地高辛標記的dUTP 熒光素標記的dUTP 顯色系統(tǒng)： 辣根過氧化物酶標記的抗生物素抗體和DAB, 辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體和DAB, 熒光素標記的dUTP(FITC-dUTP)，流式細胞 儀或熒光顯微鏡觀察。,該技術(shù)不能區(qū)分凋亡、壞死、自溶性死亡的細胞，必須結(jié)合凋亡細胞的形態(tài)學(xué)特征加以判斷： 凋亡細胞成單個或少數(shù)幾個孤立地分布在組織中； 具有

31、凋亡細胞的核特征，核固縮，顯一個或多個染色體團塊，或凋亡小體； 周圍或局部無炎癥反應(yīng)。,三、流式細胞儀檢測 flow cytometer,（一）PI 單染 （二） Hoechst33342 / PI雙染色 （三）Annexin/ PI雙染色,流式細胞儀 flow cytometer熒光激活細胞分類器 fluorescent activated cell sorter, FACS,Hoechst33342是雙苯并咪唑家族成員，能特異性與DNA螺旋小溝中AT結(jié)合。它能被活細胞攝入，也能在攝入后被細胞排出。 活細胞對碘化丙錠（PI），溴化乙錠（EB）有拒染性，當(dāng)細胞被這些染料著染，提示為晚期凋亡或壞

32、死。,（一） PI 單染,細胞凋亡之初，由于核酸內(nèi)切酶的激活，將DNA從核小體間切斷，產(chǎn)生游離寡核苷酸片段。這些片段彌散到胞漿中，但是細胞膜完整，不能離開細胞。 乙醇固定，PBS洗滌，使細胞膜通透性增加，并從細胞漿彌散出胞外。但是大分子DNA在胞內(nèi)，不能被抽提。 壞死細胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于細胞壞死時部分DNA變性，引起更多的可染位點。,原理：,收集細胞 ，PBS洗滌 冷70乙醇固定12 h以上 離心，PBS洗滌，400目篩網(wǎng)過濾 PI（含RNase）染色 流式細胞儀檢測,操作：,判斷： 在直方圖上，Go/G1期前有一個亞二倍體峰。 （檢測晚期凋亡，但不能判斷

33、是晚期凋亡還是壞死）,PI單染檢測細胞周期改變,細胞周期分析,（二） Hoechst33342/PI雙染色 染料配制： Hoechst33342：配10 ug/ml, 4避光保存。 PI：5 ug/ml, 4避光保存。,原理： 凋亡細胞膜在早期是完整的，但細胞膜的通透性已有增加，因此進入早期凋亡細胞的Hoechst比正常細胞多；而EB、PI等不能進入凋亡細胞。 即正常細胞不經(jīng)固定，對EB、PI是拒染的。而壞死細胞早期就被破壞，能被這些染料染色。,操作： 懸浮細胞Hoechst3 3342 ，終濃度1ug/ml, 貼壁細胞消化后，培養(yǎng)液重懸，加Hoechst， 37,7-10 min， 離心，洗滌， 加 PI，4避光15 min， 400目濾網(wǎng)過濾， 流式細胞儀檢測。,結(jié)果判斷： 在雙變量流式細胞儀散點圖上 正常細胞 Hoechst (-), PI