13第十三章-免疫學檢測技術

1、第十二章 免疫學技術,第一節(jié)、抗體的制備,一、抗血清的制備 （一）用于免疫的動物 主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等， 抗原來源與動物種屬的關系：種屬差異越遠，免疫原性越強。 動物種類的選擇：根據抗原的生物學特性和所要獲得抗血清數量。 一般制備抗血清，多用家兔和山羊，因其反應良好，能夠提供足夠數量的血清。,用于免疫的動物應適齡，健壯，無感染性疾患，雄性， 注意飼養(yǎng)，消除個體差異，及免疫過程中的死亡。 家兔中純種新西蘭兔最好，一組三只，兔的體重以23kg為宜。,（二）免疫途徑 如肌肉內、皮內、皮下、靜脈內、腹腔內、淋巴結內注射等， 一般用皮下或背部多點皮內注射，每點注射0.1ml左右。 途徑

2、的選擇決定于抗原的生物學特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物學活性抗原，一般不宜采用靜脈注射。,（三）佐劑 注射抗原時加入的能增強抗原的抗原性、刺激機體產生較強免疫反應的物質，稱為免疫佐劑。,佐劑的作用： 延長抗原體內存留時間 增加抗原刺激作用 刺激免疫活性細胞增多 促進T細胞與B細胞互作。,不完全福氏佐劑：羊毛脂：石臘油=1： 5，視需要可調整為1：29（V/V）， 福氏完全佐劑：在每毫升不完全佐劑加入120mg卡介苗。,配制方法： 按比例將羊毛脂與石臘油置容器內，用超聲波混勻，高壓滅菌，置4下保存。 免疫前取等容積佐劑與免疫原溶液混合，振蕩器混勻成乳狀，也可研磨均勻后再邊磨邊滴加入等容積

3、抗原液，加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，至滴于冰水上510min內完全不擴散為止。,為避免損失抗原，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復抽吸，約數十分鐘后即完全乳化。,（四）免疫方法 抗原劑量：首次為300500g，加強免疫約為首次的1/4左右。 每23周加強免疫一次。加強免疫時用不完全佐劑， 首次免疫時皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加強免疫時不用。,第2次加強免疫后2周，耳緣靜脈取血23mL，制血清，測抗體效價。 如未達到預期效價，需再進行加強免疫，直到滿意時為止。 抗體效價達到預期水平時，即可放血制抗血清。,（五）抗血清的采集與保存 耳緣靜脈或耳動脈放

4、血 頸動脈放血 心臟采血,耳緣靜脈或耳動脈放血： 將兔放入一個特造的木匣或籠內，耳露于箱（籠）外，也可由另一人捉住兔身。 剪去耳緣的毛，用少許二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管擴張、充血。,用手輕拉耳尖，以單面剃須刀或尖的手術刀片，快速切開動脈或靜脈，血液即流出，每次可收集3040ml 。 然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。 二星期后，可在另一耳放血。此法可反復多次放血。,頸動脈放血： 將兔仰臥，固定于兔臺，剪去頸部的毛，切開皮膚，暴露頸動脈，插管，放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。,血清析出： 收集的血液室溫下1h左右凝固，然后置4過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10m

5、in。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2mL），貯于-40以下冰箱，或凍干后于4 冰箱保存。,（六）抗血清質量的評價 不同的動物，同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化。 必須經常采血測試。 只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。,1抗血清的效價：就是指血清中所含抗體的濃度或含量。,（1）放射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質放射性標記抗原混合，孵育24h后，測定其結合率。 通常以結合率為50%的血清稀釋度為效價。 結合率：放射強度的檢測的變化 如某抗血清的結合率為50%時的稀釋度為1：15000，則該血清的效價就

6、是1：15000。,影響抗血清效價測定的因素 抗血清本身的性質 受標記抗原的質量 孵育時間 所用稀釋液的成分 pH,（2）雙向擴散法： 利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴散，兩者在相交處產生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。,瓊脂板的制備：100ml pH7.1 的磷酸鹽緩沖液加到15g的瓊脂內，于水浴中加溫，攪拌，使瓊脂完全溶解，趁熱用紗布過濾，待溶液冷卻到65左右時，加入疊氮鈉（NaN3），使其在溶液中的濃度為0.1%。用移液管把瓊脂放在干凈平皿或玻片上，約3mm厚，待其冷卻，完全凝固后，用打孔器打孔。,中央孔內加適量抗原（容量為50l），周圍各孔內分別加入50l 1：2、1

7、：4、1：8、1：16、1：32及不稀釋的抗血清，37下孵育24h，觀察有無沉淀線產生，以判斷血清的稀釋度。,2特異性測定 特異性：抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的識別能力。 特異性是以交叉反應率來表示。 交叉反應率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。 交叉反應率：用競爭抑制曲線來判斷。,以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率，求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。 S=y/Z100% S：交叉反應率，y：IC50時抗原濃度，Z：IC50時近似抗原物質的濃度。,如某抗原的IC50濃度為90Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大

8、，可以說這一抗血清與其它抗原物質的交叉反應率近似零，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。,3親合力 抗體與結合抗原體的活度或牢固度。 影響親合力的因素： 抗原分子的大小 抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度。,親合力常以親合常數K表示。 K的單位是升/摩爾（L/mol）。K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/H，H是最小檢出量，通常，K的范圍在10 10 L/mol之間，也有高達10 L/mol的。 計算親合常數的方法20余種，計算出的K都不能真實反映實驗情況，只能作為參考。,8,12,14,(七）免疫失敗的原因及措施,1、動物的種屬及品系不合適?？煽?/p>

9、慮改變動物的種屬或品系，或擴大免疫動物的數量。 2、抗原質量不好?？筛挠闷渌鼜S家的產品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。 3、制備的免疫原不符合要求?？蓮呐悸搫?，載體、抗原或載體的比例、反應時間等多方面去考慮，并加以改進。,4、佐劑：乳化是否完全，可改用其它佐劑，或加強乳化。 5、免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間、次數，免疫的途徑是否合適？ 6、動物的飼養(yǎng)：如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。,一、酶聯免疫吸附測定法,第二節(jié) 免疫學檢測技術,1、基本原理 采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，

10、然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。,3種必要的試劑： 、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑） 、酶標記的抗原或抗體（標記物） 、酶作用的底物（顯色劑）,、基本步驟 抗原（抗體）先結合在固相載體上，但仍保留其免疫活性， 然后加一）種抗體（抗原與酶結合成的偶聯物（標記物），此偶聯物仍保留其原免疫活性與酶活性， 當偶聯物與固相載體上的抗原（抗體）反應結合后，加酶的底物，即起催化水解或氧化還原反應而呈顏色。 其所生成的顏色深淺與欲測的抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標儀）加以測定。,ELISA的優(yōu)點

11、： 簡單，方便訊速，特異性強。,1）直接ELISA：待測抗原直接包被塑料微量滴定板，然后加入抗原特異性的酶-特異性抗體偶聯物。因為所用的酶已經標記在特定的抗體上，可檢測的病毒種類只能局限于某一種。,2）間接ELISA：待測抗原直接包被微量滴定板，然后加入特異性抗體，再加入酶標抗體。與直接ELISA相比，間接ELISA適用的范圍更為廣泛，并且特異性也較好。,間接ELISA法,3）夾心ELISA： 使用俘獲抗體（包括單抗和多抗）包被微量滴定板，其余步驟同間接ELISA。 根據包被抗體種類的不同，又可以分為同種單抗夾心ELISA，異種單抗夾心ELISA，多種單抗混合夾心ELISA和多抗夾心ELISA

12、等幾種方法。 與間接ELISA相比，夾心ELISA多了一步以抗體俘獲富集抗原的過程，因而其靈敏度和特異性也相應提高。但是對有些病毒的株系，夾心ELISA并不是很好的選擇。這可能與單克隆抗體識別的是蛋白亞基的抗原表位還是病毒粒子表面的抗原表位有關。,雙抗體夾心法,3、酶及其底物 酶結合物：酶與抗體或抗原、半抗原在交聯劑作用下聯結的產物。 可進行抗體或抗原的特異免疫反應且有酶活性。 不同的酶、不同的底物，有不同的顏色反應。,二、雙向免疫擴散試驗,1、基本原理,瓊脂糖的疏散網狀結構有利于大分子的自由遷移 合適比例的抗原抗體結合后聚集形成沉淀帶 沉淀帶形成一種特異性的半滲透性屏障，阻滯相同抗原抗體復合

13、物，而允許不同的分子通過。,應用： 疾病診斷： 抗體檢測：,3、操作步驟,（1）瓊脂玻板的制備 將溶化的1.5%瓊脂倒在培養(yǎng)皿中，使之能將表面覆蓋，制成厚度約23mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據所需形狀打孔。（切勿劇烈振蕩融化后的瓊脂糖，防止氣泡的出現。）,（2）免疫擴散及結果觀察,注意：加樣至孔滿為止，不可外溢。待孔內液體滲入凝膠后即可放于溫盒中。濕盒于37中，一般保溫2448h，觀察抗原抗體產生的白色沉淀線。,結果記錄,三、免疫印跡檢測（Immunoblotting assays）,利用蛋白與硝酸纖維素膜或尼龍膜有很強的結合能力的特點，將經過電泳分離的蛋白從膠上轉移到膜上或者直接將蛋白點

14、到膜上，經過類似ELISA的反應，蛋白會被特異的抗體檢測。,1、主要方法： 1）、Western印跡（Western blot）：Western blot是基于電泳和血清學的技術，將電泳分離蛋白的能力和血清學反應的特異性結合起來，能夠檢測含量極少的蛋白。因此檢測的靈敏度極高。,Western blot 實驗步驟,SDS-PAGE 蛋白電泳 轉膜 封閉 一抗反應 洗膜 二抗反應 洗膜 底物現色 中止反應,2）、斑點免疫印跡（Dot-blot immuno-assay, DBIA）：在DBIA中將樣品懸浮液（1-5 l）點到硝酸纖維素膜或尼龍膜上晾干。其余步驟同Western blot。在檢測少量

15、樣品時比ELISA具有優(yōu)勢：所需試劑少，不需特別的儀器，省時，具有與ELISA相同的靈敏度。,斑點免疫印跡步驟,3）、組織免疫印跡（Tissue-blot immunoassay, TBIA）：TBIA是檢測感病植物的更為簡單的方法。直接將新鮮樣品的切割面印記到硝酸纖維素膜或尼龍膜上后按照DBIA的程序進行，可靠性和靈敏度與DBIA和ELISA相似。特別適合檢測大量樣品。,四、免疫膠體金技術（immuno-colloidal gold technology）,膠體金顆粒以靜電、非共價鍵方式吸附抗體分子，而形成穩(wěn)定的IgG-膠體金復合物。 通過抗原抗體特異性結合，抗體膠體金復合物就可以結合在抗原

16、上。 通過光學顯微鏡、透射電鏡確定病毒的復制部位或病毒產物的存在部位，亞細胞結構的定位。 也有將免疫斑點檢測中的酶標抗體換成膠體金標記抗體，因不需要酶促反應的底物，所以進一步縮短了反應的時間。,免疫層析,通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細管作用使樣品溶液在層析條上遷移，并同時使樣品中的待測物和層析材料上針對待測物的受體（如抗體或抗原）發(fā)生高特異性、高親和性免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域，通過目測的標記物（如膠體金）而得到直觀的實驗現象（如顯色）。而游離標記物則越過檢測線，達到與結合標記物自動分離的目的。,二、單克隆抗體的制備,（一）動物的選擇與免疫 （二）細

17、胞融合 （三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測 （四）雜交瘤的克隆化 （五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇 （六）單克隆抗體的大量生產 （七）單克隆抗體的鑒定,（一）動物的選擇與免疫,1動物：純種BALB/C小鼠 較溫順。 離窩的活動范圍小， 體弱，食量及排污較小， 一般環(huán)境潔凈的實驗室均能飼養(yǎng)成活。,2免疫方案 ：至關重要 （1）可溶性抗原免疫：一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。,初次免疫： 抗原150g加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.81ml,0.2ml/點）, 3周后,第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）,第三次免疫 劑量

18、同一，不加佐劑，ip（57天后采血測其效價）, 3周后,加強免疫，劑量50500g為宜，ip或iv（靜脈內注射）,2- 3周后,取脾融合, 3天后,（2）顆?？乖庖撸翰患幼魟┚涂色@得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1210 個細胞。,7,（二）細胞融合,1細胞融合前準備 （1）骨髓瘤細胞系的選擇： 骨髓瘤細胞應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。 常用的骨髓瘤細胞系見表。,常用于融合試驗的骨髓瘤細胞系,骨髓瘤細胞的培養(yǎng) 可用RPMI1640，DMEM培養(yǎng)基。 小牛血清的濃度一般在10%20%，細胞濃度以10 51

19、0 /mL為宜，最大濃度不得超過10 /mL 細胞處于對數生長的中期時，可按1：31：10的比例傳代。每35天傳代一次。 細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。,4,5,6,（2）飼養(yǎng)細胞： 組織培養(yǎng)中，單個或少數分散的細胞不易繁殖，加入其它活細胞后可促進這些細胞的繁殖，所加入的這種細胞稱為飼養(yǎng)細胞。 在制備McAb的過程中，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中，加入飼養(yǎng)細胞是十分必要的。 常用的飼養(yǎng)細胞如：小鼠腹腔巨噬細胞，小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。 飼養(yǎng)細胞的量為一般為210 或10 細胞/孔

20、。,4,5,2細胞融合的步驟 （1）制備飼養(yǎng)細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。,（2）制備免疫脾細胞,最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死 無菌取脾臟，培養(yǎng)液洗 一次 脾臟研碎，過不銹鋼篩網 離心，細胞用培養(yǎng)液洗2次 計數 取10 脾淋巴細胞懸液備用,8,（3）制備骨髓瘤細胞,取對數生長骨髓瘤細胞離心 用無血清培養(yǎng)液洗2次 計數，取得10 細胞備用,7,（4）融合 、將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5混合，在50ml離心管中用無血清不完全培養(yǎng)液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略松動。 、90s內加

21、入37預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37水浴作用90s。 、加37 預溫的不完全培養(yǎng)液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。,、離心，800rpm, 6min。 、棄上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養(yǎng)液重懸。 、將上述細胞，加到已有飼養(yǎng)細胞層的96孔板內，每孔加100l。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。 、將培養(yǎng)板置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,（三）選擇雜交瘤細胞及抗體檢測,1HAT選擇雜交瘤細胞 脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理后，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。

22、 在HAT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時，由于骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養(yǎng)液可以生長繁殖。,用HAT選擇培養(yǎng)34天后瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落。 HAT選擇培養(yǎng)液維持710天后應換用HT培養(yǎng)液，再維持2周，改用一般培養(yǎng)液。 在選擇培養(yǎng)期間，一般每23天換一半培養(yǎng)液。 選擇培養(yǎng)期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。,2抗體的檢測 （1）放射免疫測定（RIA）: 用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。 （2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）: 用于可溶性抗原、細胞和病毒等Mc

23、Ab的檢測。 （3）免疫熒光試驗: 適于細胞表面抗原的McAb的檢測。 （4）其它：如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。,（四）雜交瘤的克隆化,雜交瘤克隆化：將抗體陽性孔進行克隆化。 因為經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。 在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。 克隆化: 將這些細胞彼此分開。,克隆化的原則：對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制。 克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞

24、的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。,克隆化的方法,有限稀釋法克隆 （1）克隆前1天制備飼養(yǎng)細胞層（同細胞融合）。 （2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養(yǎng)孔內輕輕吹干，計數。 （3）調整細胞為310個細胞/ml。 （4）取頭天準備的飼養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)板，每孔加入稀釋細胞100L。孵育于37、5%CO2孵箱中 。 （5）在第7天換液，以后每23天換液1次。 （6）89天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。 （7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養(yǎng)。 （8）每個克隆應盡快凍存。,軟瓊脂培養(yǎng)法克隆 （1）軟瓊脂的配制：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。 1%瓊脂水溶液

25、：高壓滅菌，42預熱。 0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42保溫。 （2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養(yǎng)細胞）15ml傾注于直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固后作為基底層備用。 （3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配制需克隆的細胞懸液。 （4）1ml 0.5%瓊脂液（42預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。 （5）混勻后立傾注于瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育于37、5%CO2孵箱中。 （6）45天 后即可見針尖大小白色克隆，710天后，直接移種至含飼養(yǎng)細胞的24孔板中進行培養(yǎng)。 （

26、7）檢測抗體，擴大培養(yǎng)，必要是地再克隆化。,（五）雜交瘤細胞的凍存與復蘇,1雜交瘤細胞的凍存 未凍存細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。 如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。,凍存方法： 每支安瓿含細胞應在110 以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。 細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養(yǎng)液；10%DMSO（二甲基亞砜）。,6,凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。 凍存時從室溫可立即降至0后放入-70超低溫冰箱，次日轉入液氮中，保存數年或更長時間 凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性。,2細胞復蘇 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍。 將細胞用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內，置37、5%CO2孵箱中培養(yǎng) 當細胞形成集落時，