第22章-免疫學檢測技術(shù)的基本原理

1、免疫學檢測技術(shù)的基本原理,一. 體外抗原抗體反應(yīng)的特征 1.高度特異性 抗原的表位與抗體的抗原結(jié)合點結(jié)構(gòu)互補。 2.可見性 抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合后能肉眼直接觀察。 二. 抗原抗體反應(yīng)的影響因素 1.溫 度：最適溫度為37。 2.酸堿度：最適pH =6-8。 3.電解質(zhì)：可促進抗原與抗體的結(jié)合。 常用生理鹽水。,抗原抗體比例對反應(yīng)現(xiàn)象的影響,三. 檢測抗原和抗體的體外試驗 （一）凝集反應(yīng) 顆粒性抗原（RBC、細菌等）與相應(yīng)抗體 結(jié)合形成肉眼可見凝集物的現(xiàn)象或反應(yīng)。 1直接凝集試驗 （1）玻片凝集試驗：用于定性測抗原。 如ABO血型鑒定，細菌的鑒定、分型等。 （2）試管凝集試驗：用于定量測抗體 如肥

2、達氏反應(yīng)。 2間接凝集試驗 如類風濕因子的測定等。,（二）沉淀反應(yīng) 可溶性抗原（血清蛋白、組織浸液等）與 相應(yīng)抗體結(jié)合而形成可見沉淀物的反應(yīng)。 因該類反應(yīng)多在半固體瓊脂凝膠中進行，故 又稱為瓊脂擴散試驗或免疫擴散。,1單向免疫擴散 用于定量測抗原。 如檢測血清免疫球蛋白、C3等含量 。,2雙向免疫擴散 主要用于定性檢測抗原或抗體，抗原組成及兩 種抗原相關(guān)性分析。,3免疫電泳 其方法是先電泳、后擴散。主要用于抗原成分的分析，亦可用于診斷如骨髓瘤、性聯(lián)低丙種球蛋白血癥等的診斷。,4免疫比濁 用于定量測抗原。該法快速、簡便。,5）免疫比濁法,在一定量的抗體中分別加入遞增量的抗原，經(jīng)一定時間后形成免疫

3、復(fù)合物。用濁度計測量反應(yīng)液體的濁度，復(fù)合物形成越多，濁度越高，繪制標準曲線并根據(jù)反應(yīng)液體的濁度，推算樣品中的抗原含量。,（三）免疫標記技術(shù) 用熒光素、同位素或酶等示蹤物質(zhì) 標記抗體 （或抗原）進行抗原-抗體反應(yīng)。 標記物質(zhì)與抗體（或抗原）的化學連接未改變 抗體（或抗原）的免疫學特性，且極大的提高了 反應(yīng)的靈敏度，可以對微量物質(zhì)進行定量、定性 或定位檢測。 免疫標記技術(shù)主要有三種基本類型： 免疫熒光技術(shù) 免疫酶技術(shù) 同位素標記技術(shù),1免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescence Technique) 用熒光素與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應(yīng)，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復(fù)合物散

4、發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。 （1）常用熒光素 異硫氰酸熒光素（FITC）， 顯黃綠色。 藻紅蛋白（PE），顯紅色。 （2）方法 *直接熒光法： 優(yōu)點-特異性強 缺點-每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體。 *間接熒光法 優(yōu)點-敏感性比直接法高，且制備一種熒光素標記的二抗可 用于多種抗原的檢測， 缺點-非特異性熒光增加。,2酶免疫測定（ Enzyme Immunoassay, EIA） 用酶標記的抗體進行的抗原抗體反應(yīng)。EIA將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶催化作用的高效性相結(jié)合，通過酶作用于底物后顯色來判定結(jié)果。 其檢測的敏感度可達pg-ng/ml水平。 Ab + E AbE Ag

5、+ AbE AgAbE + 底物 呈色反應(yīng),EIA,（1）標記的酶： 辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）。 （2）常用方法: A 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除. 用于可溶性抗原和抗體的檢測。,* 間接法：用于檢測抗體,* 雙抗體夾心法：用于檢測抗原。,B 免疫組化技術(shù)檢測組織中或細胞表面的抗原。 對抗原進行定性、定量、定位檢測。 C 酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT） 可用于細胞因子的檢測,3放射免疫測定法（RIA） 敏感度可達pg水平， 其標記物為125I、131I等。 常用于微量物質(zhì)的檢測，如激素、IgE等。,4化學發(fā)光免疫分析 該法是將發(fā)光物吖啶酯、或魯米諾標記抗原或抗體進行的結(jié)合反應(yīng)。 發(fā)光物質(zhì)在反應(yīng)劑激發(fā)下生成激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時發(fā)射出光子，用自動發(fā)光分析儀能接收光信號，測定光子的產(chǎn)量，以反映待檢樣品中抗體或抗原的含量。其靈敏度高于RIA，常用于超微量物質(zhì)的測定， 如甲狀腺素等。,5免疫印跡法（Western blotting） 該法是將凝膠電泳與固相免疫相接合的檢測技術(shù)，即