[免疫學]實驗2課件

1、實 驗 二,一、凝集反應 二、沉淀反應 三、免疫血清的制備（2）：家兔心臟采血,目的要求,（一）掌握凝集反應、沉淀反應原理、方法及用途。 （二）熟悉實驗的操作手法。,一 、凝集反應,定義：顆粒性抗原（病原微生物或紅細胞）與相應的抗體特異性結合，在電解質存在的條件下，如果兩者比例適當，在一定的溫度下經過一定的時間，可以形成肉眼可見的凝集塊，這種現(xiàn)象叫做凝集反應。 分類： 直接凝集反應 間接凝集反應 間接凝集抑制反應,直接凝集反應,細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒性抗原在適當電解質存在的條件下，可以直接與相應的抗體特異性結合，形成肉眼可見的凝集塊。,玻片凝集： 細菌鑒定 ABO血型鑒定,1、細菌鑒定,原

2、理： 將已知抗體直接與未知的顆粒性抗原物質（細菌）混合，在有電解質存在的條件下，如兩者對應則發(fā)生特異性結合，而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對應便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性。 此法屬定性試驗，主要用于細菌鑒定和分型等。,1、1:10稀釋的傷寒桿菌診斷血清、生理鹽水； 2、菌種：傷寒桿菌、大腸桿菌菌液 3、潔凈載玻片、記號筆、試管架等。,實驗材料,實驗流程,結果觀察,ABO血型系統(tǒng),2、ABO血型鑒定,原理： 人類ABO血型抗原分A、B兩種。A型血者紅細胞膜上有A抗原，B型血者紅細胞膜上有B抗原，AB型有A、B兩種抗原，O型則不含A、B抗原。 用已知的抗A或抗B抗體與受檢者紅細胞混合，抗A

3、和或抗B抗體與紅細胞表面上的相應抗原結合而引起紅細胞凝集，根據(jù)其凝集狀況判定受試者的血型。,1、抗A 及抗B抗體、生理鹽水； 2、玻片、采血針、試管、滴管、消毒棉棒、牙簽、記號筆等。,實驗材料,注意事項 1.消毒處干燥后再取血 2.滴管不可與抗體液面接觸 3.牙簽不可混用,步驟,結果觀察,A型,B型,AB型,O型,抗A 抗B,二、沉淀反應,原理 可溶性抗原（多糖、蛋白質、類脂等）與相應抗體特異性結合，兩者比例適當并有電解質存在及一定溫度的條件下，經過一定的時間，可形成肉眼可見的沉淀物。,環(huán)狀沉淀 免疫擴散技術：單向免疫擴散、 雙向免疫擴散 電泳技術：對流免疫電泳、免疫電泳、火箭免疫電泳,沉淀反

4、應可在液體中進行，如 環(huán)狀沉淀。 沉淀反應大多用半固體瓊脂凝膠為介質進行瓊脂擴散或稱免疫擴散。,1、環(huán)狀沉淀反應,將少量高濃度的抗體置于小試管底層，再將抗原沿管壁徐徐加入，使之重疊于抗體的上面，室溫下靜置數(shù)分鐘，可以看到在抗原與抗體的接觸面形成白色沉淀環(huán)。 此試驗常用于抗原的定性試驗。,實驗器材 免疫血清（抗體） 抗原 小沉淀管、毛細吸管、生理鹽水。,陽性 陰性,將2只沉淀管分別標明1、2。 每只試管加入1/3高度抗體。 1管加入等量抗原，2管加入等量NS。 靜置5mins，觀察結果。,實驗流程,注意事項 1.加樣時將沉淀管傾斜約45 2.緩慢加樣，不可破壞兩液 體之間的液面,將某種特異性抗體

5、混合于瓊脂中，再于其上打孔，將一定量的抗原加入孔中?？贵w不會再擴散 ，孔中抗原向四周呈輻射狀擴散。如抗原與已知的抗體相對應，在兩者比例適合處即出現(xiàn)由IC所形成的沉淀環(huán)，直徑大小與抗原濃度成正比。,2、單向免疫擴散（示教）,定性和定量,可溶性抗原與抗體分別加到瓊脂板上相應的小孔中，兩者各自向四周擴散，若抗原與抗體相對應，兩者相遇即發(fā)生特異性結合，并在比例合適處形成白色沉淀線。,3、雙向免疫擴散（示教）,此試驗可用已知抗體（或抗原）檢測未知抗原（或抗體）。,1、1.2生理鹽水瓊脂。 2、待檢抗原血清、肝癌病人AFP陽性血清。 3、AFP診斷血清（含AFP抗體）。 4、載玻片、瓊脂板、打孔器、微量加

6、樣器、吸管等。,實驗器材,實驗步驟,原理 帶電的膠體顆粒在電場中移動的方向與其所帶電荷有關?？乖趐H8.6的緩沖液中帶負電荷，由陰極向陽極移動?？贵w為球蛋白，只帶微弱的負電荷，分子量又大，因為電滲作用反而向負極倒退。當抗原與抗體在瓊脂兩孔間相遇時，在兩者比例適當處形成白色沉淀線。,4、對流免疫電泳實驗,（在雙向擴散基礎上加電泳的方法）,由于抗原、抗體在電場中定向移動，被限制了多方向自由擴散的傾向，因而提高了實驗敏感度。而且，沉淀線出現(xiàn)較快，可在1小時之內觀察結果，所以可用于快速診斷。,材料,1、抗AFP血清，已知AFP陽性血清，待檢血清。 2、微量加樣器、打孔器、電泳儀等。,實驗步驟,1、制

7、備瓊脂板，按照模板打孔 2、加樣：分別向1、3孔內加入抗AFP血清；向2孔內加肝癌病人 AFP陽 性血 清作為陽性對照，4孔內加待檢病人血清。 3、通電：將瓊脂板置于電泳槽內，抗原端放陰極側，抗體放陽極側，固定 電壓56v/cm，通電45min左右。,抗AFP血清,抗AFP血清,1,3,2,4,1,3,2,4,注意事項 打孔時將孔內瓊脂全部吸出、盡量不破壞孔邊緣瓊脂 加樣時不可溢出或加入氣泡，不可將瓊脂吹起 電泳時分清正、負極 （試驗完畢請將瓊脂棄入垃圾袋）,?,三、免疫血清的制備（2）：家兔心臟采血,原理： 將適當?shù)目乖镔|注入動物體內，經過一定時間后，動物血清中可以產生大量的特異性抗體，這

8、種含有特異性抗體的血清稱為免疫血清。 取羊紅細胞免疫家兔一只，心臟采血，分離血清，血清中含有特異性抗體（抗羊紅細胞抗體）。,實驗材料,免疫家兔； 消毒棉球、注射器、試管、離心機等。,固定家兔，用碘酒、酒精棉球消毒心前區(qū)皮膚。 在胸骨左緣外側1-2cm左右、3-4肋間，選擇心跳最明顯處進針。（注射部位正確時，血液會自動涌入針管） 體重2kg左右的家兔，每次抽血一般不超過4-5ml，收集血液于無菌試管中。 放在試管架上，凝固4-5h后，離心，收集血清。,實驗步驟：,注意事項：,取血部位要準確，不要劃破家兔心臟，盡量不令動物死亡； 見到回血再取血； 向試管中注射血液時要將針頭取下。,小結,抗原抗體檢測：特異性、可見性 凝集反應:顆粒性抗原 直接凝集反應 玻片凝集-定性 沉淀反應：可溶性抗原 定性：環(huán)狀沉淀、雙擴、對流免疫電泳,實驗報告,1.細菌鑒定的原理、步驟、結果和分析， 2