HPCE毛細(xì)管電泳技術(shù)及應(yīng)用(1)

1、HPCE技術(shù)及應(yīng)用,電 泳,在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)分離。,1808年，Reuss（俄國(guó)）首次發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。 1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白質(zhì)混合液的分離： 發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定； 第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀； 1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；,經(jīng)典電泳,利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行分離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。 按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳； 按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳

2、、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳； 傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，分離效率低，定量困難，無(wú)法與其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬(wàn)/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速發(fā)展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的分離分析技術(shù)毛細(xì)管電泳。,毛細(xì)管電泳（ capillary electrphoresis，CE）和傳統(tǒng)電泳的根本區(qū)別在于前者設(shè)法使電泳過(guò)程在散熱效率極高的毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行，從而確保引入高的電場(chǎng)強(qiáng)度，全面改善分離質(zhì)量。,20世紀(jì)3040年代 蒂塞利烏斯(A.W.K.Tiselius）建立了移動(dòng)界面電泳，將電泳發(fā)展成分離技術(shù) 獲得19

3、48年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng),毛細(xì)管電泳（Capillary Electrophoresis, CE）,高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)： 采用了25-100m內(nèi)徑的毛細(xì)管； 采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。 毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。 電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加， 毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于HPLC，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。,分離過(guò)程,電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管柱中出現(xiàn)：電泳現(xiàn)象和電滲流現(xiàn)象。,帶電粒子的遷移速度=電泳+電滲流；兩種速度的矢量和。 陽(yáng)離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子無(wú)

4、電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出； 陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反。電滲流 電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出 除中性粒子外,同種類離子由于受到的電場(chǎng)力大小不一樣也同時(shí)被相互分離。,毛細(xì)管電泳的特點(diǎn),1. 柱效高,高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬(wàn)塊/米，特殊柱子可以達(dá)到數(shù)百萬(wàn)。,2.消耗低,CE所需樣品為nl級(jí), 流動(dòng)相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為l級(jí), 流動(dòng)相則需幾百毫升乃至更多。,3.速度快,一般幾十秒至十幾分，最多半小時(shí)，即可完成一個(gè)試樣的分析。,4.應(yīng)用廣泛,通過(guò)改變操作模式和緩沖液的成分，CE有很大的選擇性，可以根據(jù)不同的分子性質(zhì)，對(duì)極廣泛的對(duì)

5、象進(jìn)行有效的分離。,CE分離有機(jī)分子、藥物分子，特別是手性分子和生物大分子方面的能力，對(duì)HPLC地位提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。,一、CE基本原理 二、電滲現(xiàn)象與電滲流electroosmotic flow 三、影響電滲流的因素 四、淌度mobility 五、CE中的參數(shù)與關(guān)系式 六、影響分離效率的因素,毛細(xì)管電泳理論基礎(chǔ),電泳是溶液中帶電粒子在電場(chǎng)力作用下發(fā)生定向運(yùn)動(dòng)，因粒子所帶電荷數(shù)、形狀、大小等不同，導(dǎo)致不同的遷移速度而分離。色譜是不同組分在流動(dòng)相的推動(dòng)下，由于在固定相流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，導(dǎo)致不同的遷移速度而分離。但某些毛細(xì)管電泳的分離模式也包含了色譜的分離機(jī)制。,電泳和色譜的分離過(guò)程都是差速

6、遷移過(guò)程，可用相同的理論來(lái)描述。色譜中所用的一些名詞概念和基本理論，如保留值、塔板理論、速率理論等均可借用于毛細(xì)管電泳中。,電滲現(xiàn)象與電滲流 electroosmosis and electroosmotic flow,1.電滲流現(xiàn)象 當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體表面由于某種原因帶一種電荷，則因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差。,當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體表面的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。 電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流（electroosmotic flow ，簡(jiǎn)稱EOF）。,2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲

7、流,石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH3時(shí)，表面電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。,在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽(yáng)離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度電滲流。,在外電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下產(chǎn)生的電滲流為平流，即塞式流形。液體流動(dòng)速度除在管壁附近因摩擦力迅速減小到零以外，其余部分幾乎處處相等。這一點(diǎn)和HPLC中靠泵驅(qū)動(dòng)的流動(dòng)相的流形完全不同。,3.電滲流的流形,HPLC流動(dòng)相的流形為拋物線形的層流，在管壁處的速度為零，管中心的速度是平均速度的2倍，引起的譜峰展寬較大。,電滲流呈平流，引起的譜峰展寬很小，是毛細(xì)管電泳能獲得較HPLC更高分離效率的重要

8、原因。,4. 電滲流的作用,電滲流通常流向負(fù)極，電滲流速度約等于一般離子電泳速度的57倍。所以，各種電性物質(zhì)在毛細(xì)管中的遷移速度為兩種速度的矢量和，稱為表觀電泳速度，用vap表示。,陽(yáng)離子： vapvos+vep 陰離子： vapvosvep 中性分子： vapvos,當(dāng)把試樣從陽(yáng)極端注入到毛細(xì)管內(nèi)時(shí)，不同電性的粒子將按不同的速度向負(fù)極遷移，從負(fù)極端先后流出毛細(xì)管。出峰次序是： 陽(yáng)離子中性分子陰離子 中性分子與電滲流速度相同，不能互相分離。,vap=apE=(osep)E,電滲流具有像HPLC中泵一樣的作用，推動(dòng)離子前進(jìn)，加上不同離子電泳速度和方向的差異，完成陽(yáng)離子、陰離子和中性離子的分離。,

9、改變電滲流的大小和方向，可以改變分離效率和選擇性。這是HPCE中優(yōu)化分離的重要因素。,電滲流在HPCE 的分離中起著極其重要的作用：,電滲流的微小變化影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積） 。,電泳中影響電滲流的因素很多，應(yīng)設(shè)法控制電滲流的恒定。,三、HPCE中影響電滲流的因素,1.電場(chǎng)強(qiáng)度的影響 電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。,2.毛細(xì)管材料的影響,酸度影響毛細(xì)管的表面Si-OH基的電離，特別是在pH47范圍內(nèi)，影響更顯著，此時(shí)溶液pH值與EOF成近線性關(guān)系,CE中電滲流的方向,電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面電荷的性質(zhì)： 內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液帶正

10、電荷，電滲流流向負(fù)極； 內(nèi)表面帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向正極； 石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極； 改變電滲流方向的方法： （1）毛細(xì)管改性 表面鍵合陽(yáng)離子基團(tuán)； （2）加電滲流反轉(zhuǎn)劑 內(nèi)充液中加入大量的陽(yáng)離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向正極。,3. 電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響,（1）溶液pH的影響 對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，達(dá)到最大； pH3，完全被氫離子中和，表面電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來(lái)保持pH穩(wěn)定。 （2）陰離子的影響 在其他條件相同，濃度相同而陰離

11、子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的焦耳熱不同。 緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。,4. 溫度的影響,毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來(lái)自于“焦耳熱”； 焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過(guò)時(shí)，產(chǎn)生的熱量； CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%3%；,5. 添加劑的影響,（1）加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。,（2）加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。 （3）加入表面

12、活性劑，可改變電滲流的大小和方向； 加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢(shì)增大，電滲流增大； 加入不同陽(yáng)離子表面活性劑來(lái)控制電滲流。,淌度 Mobility,淌度：帶電離子在單位電場(chǎng)下的遷移速度； 淌度不同是電泳分離的基礎(chǔ)。 1.絕對(duì)淌度(absolute mobility)ab 無(wú)限稀釋溶液中帶電離子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的平均遷移速度，簡(jiǎn)稱淌度?？稍谑謨?cè)中查閱。 2.有效淌度(effective mobility)ef 實(shí)際溶液中的淌度(實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的)。 ef=aii ai 溶質(zhì)i 的解離度；i 溶質(zhì)i 在解離狀態(tài)下的絕對(duì)淌度,影響分離效率的因素區(qū)

13、帶展寬,1.縱向擴(kuò)散的影響 在HPCE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：2=2Dt 由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率，大分子生物試樣分離的依據(jù)。 2.進(jìn)樣的影響 當(dāng)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長(zhǎng)度： Winj= (24D t )1/2 實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長(zhǎng)度小于或等于毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%2%。,3.焦耳熱與溫度梯度的影響,散熱過(guò)程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。 改善方法： （1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑； （2）控制散熱；,4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用,存在吸附與疏水作用，造成譜帶展寬； 蛋白質(zhì)

14、、多肽帶電荷數(shù)多，有較多的疏水基，吸附問(wèn)題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。 細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機(jī)會(huì)。 減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時(shí)，抑制對(duì)蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對(duì)電滲流影響不大。,5.其他影響因素,（1）電分散作用對(duì)譜帶展寬的影響 當(dāng)溶質(zhì)區(qū)帶與緩沖溶液區(qū)帶的電導(dǎo)不同時(shí)，也造成譜帶展寬；盡量選擇與試樣淌度相匹配的背景電解質(zhì)溶液。 （2）“層流”現(xiàn)象對(duì)譜帶展寬的影響 一般情況下，CE中不存在層流，但當(dāng)毛細(xì)管兩

15、端存在壓力差時(shí)，出現(xiàn)拋物線形的層流； 產(chǎn)生的原因：毛細(xì)管兩端液面高度不同。 實(shí)際操作時(shí)，保持毛細(xì)管兩端緩沖溶液平面高度相同。,一、高效毛細(xì)管電泳儀 二、流程與主要部件 三、進(jìn)樣方式 四、檢測(cè)器,毛細(xì)管電泳儀,儀器流程與主要部件,電壓：030kV； 分離柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器； （可檢測(cè)到：10-1910-21 mol/L）,1.高壓電源,（1）030 kV 穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源； （2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出； （3）電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)； （4）電壓穩(wěn)定性：0.1%； （5）電源極性易轉(zhuǎn)換；,2. 毛細(xì)管柱 （1）材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差

16、； （2）規(guī)格：內(nèi)徑2075m，外徑350400m；長(zhǎng)度=1m,3.緩沖液池,化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好； 4. 檢測(cè)器 要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)； 檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；,類型 檢測(cè)限/mol 特點(diǎn) 紫外-可見(jiàn) 10-1310-15 加二極管陣列，光譜信息 熒光 10-1510-17 靈敏度高，樣品需衍生 激光誘導(dǎo)熒光 10-1810-20 靈敏度極高，樣品需衍生 電導(dǎo) 10-1810-19 離子靈敏，需專用的裝置；,CE具體操作步驟： 毛細(xì)管電泳的基本步驟包括清洗毛細(xì)管、更換電泳緩沖液、進(jìn)樣、電泳并同時(shí)在線檢測(cè)。 1).清洗毛細(xì)管 對(duì)于一根新的或久未使用的毛細(xì)管，需用

17、1mol/L的NaOH溶液、0.1mol/L NaOH溶液、超純水依次清洗。在有些情況下還需用0.1mol/LHCl、甲醇或去垢劑清洗,強(qiáng)堿溶液可以清除吸附在毛細(xì)管內(nèi)壁的油脂、蛋白質(zhì)等，強(qiáng)酸溶液可以清除一些金屬或金屬離子，甲醇、去垢劑可去除疏水性強(qiáng)的雜質(zhì)。,在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積23倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為23 min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。,2). 更替電泳緩沖液 在進(jìn)行每次分析前可用相當(dāng)于毛細(xì)管總體積23倍的0.1mol/L的NaOH溶液清洗一遍，一般為23 min，而后注入電泳緩沖液，以保證分析結(jié)果的重復(fù)性。 上一步清洗過(guò)程

18、結(jié)束后，毛細(xì)管和電極從清洗液中移至電泳緩沖液，不可避免地將強(qiáng)堿或強(qiáng)酸等溶液帶至其中。緩沖液本身也會(huì)因揮發(fā)、電泳等而改變其離子強(qiáng)度。因此對(duì)于精確分析，每分析五次后需更換一次樣品盤中的緩沖液。一般分析，半天更換一次即可。,3）毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式,進(jìn)樣量：毛細(xì)管長(zhǎng)度的1%-2%；nL級(jí)、非常小； 1. 流體力學(xué)進(jìn)樣方式 （1）進(jìn)樣端加壓 （2）出口端抽真空 （3）虹吸進(jìn)樣,毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；,2. 電動(dòng)進(jìn)樣方式,進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度小的進(jìn)樣量大； 離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去； 特別適合黏度大的試樣； 3. 擴(kuò)散進(jìn)樣 試樣通過(guò)擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱

19、端口處。,分離模式,八種分離類型，介紹常用的幾種； 根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型； 每種機(jī)理的選擇性不同；,一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳capillary zone electrophoresis ，CZE,帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。 正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出； 中性粒子：無(wú)電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽(yáng)離子后流出；,陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反；電滲流 電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。 最基本、應(yīng)用廣的分離模式；,CZE分離條件的選擇,毛細(xì)管類型-涂層還是非涂層？ 毛細(xì)管長(zhǎng)度-長(zhǎng)毛細(xì)管還是

20、短毛細(xì)管？ 緩沖液體系-種類和pH值 添加劑類型-甲醇|環(huán)糊精|乙腈 檢測(cè)器選擇-紫外|二極管陣列|激光誘導(dǎo)熒光,緩沖溶液的選擇,可先用磷酸緩沖體系為搜尋基礎(chǔ)，初步確定（最佳）pH范圍后，再進(jìn)一步細(xì)選出更好pH和緩沖試劑。磷酸鹽是毛細(xì)管電泳中最常用的緩沖體系之一，它的紫外吸收低，pH緩沖范圍比較寬（pH=1.513），但電導(dǎo)也比較大。,緩沖溶液及pH值的選擇,研究經(jīng)驗(yàn)表明：對(duì)于蛋白質(zhì)、肽和氨基酸等兩性樣品，采用酸性（pH 2）或堿性（pH9）分離條件，比較容易得到好的分離結(jié)果；糖類樣品通常在pH=911之間能獲得最佳分離；羧酸或其他樣品多在pH=59之間選擇分離條件。,緩沖溶液及pH值的選擇,

21、pH 的選擇也和所用的毛細(xì)管種類有關(guān)，許多涂層毛細(xì)管只能在一定的pH范圍內(nèi)工作，例如聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在3pH8的范圍以外工作，其涂層容易水解失效。,緩沖溶液及pH值的選擇,在相同的 pH下，不同緩沖體系的分離效果不盡相同，有的可能相差甚遠(yuǎn)。一般的經(jīng)驗(yàn)是，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑，有可能就是最好的試劑。一個(gè)典型的例子是，在分離糖類和DNA等分子時(shí)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因?yàn)榕鹚岣芘c糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負(fù)電荷和分離度。硼酸緩沖試劑也適用于其他含鄰位羥基或多羥基化合物的分離。,緩沖溶液及pH值的選擇,緩沖試劑及pH調(diào)節(jié)劑的濃度也需要優(yōu)化。緩沖試劑的濃度一般控制在10200 mmo

22、l/L之間。電導(dǎo)率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼砂等，其濃度多控制在20 mmol/L附近，而電導(dǎo)小的試劑如硼酸及HEPES等，其濃度可在100 mmol/L以上。有時(shí)為了抑制蛋白質(zhì)吸附等特殊目的，可采用很高（0.5mol/L）的試劑濃度，此時(shí)要注意減少分離電壓，分析速度自然也將隨之降低。,添加劑的選擇,目的： 改善分離 抑制分析物在毛細(xì)管上的吸附,添加劑的選擇,甲醇|乙腈（5-50%） 降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果 增加非極性物質(zhì)的水溶性 環(huán)糊精|SDS等表面活性劑 增加分離選擇性，提高分析效果 降低電滲流，增加分離有效距離，從而改善分離效果 非極性高分子聚合物 掩蔽毛細(xì)管內(nèi)壁電

23、荷，抑制分子吸附 降低電滲流 形成一定的分子篩，提高分子大小選擇性,二、毛細(xì)管凝膠電泳 capillary gel electrophoresis ，CGE,將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。 其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。 蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無(wú)關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DAN排序的重要手段。 特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。 無(wú)膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。,1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，

24、形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。,三、 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）Micellar electrokinetic capillary chromatography，MEKC,在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。,2. 電泳流和電滲流的方向相反，且電滲流 電泳 ，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；,5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。,3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)； 4.可用來(lái)分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；,1. 根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)； 2. 毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺

25、基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（68V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度； 3. 氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；,四、毛細(xì)管等電聚焦 Capillary isoelectric focusing，CIEF,4. 聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；,5. 陽(yáng)極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液； 6. 加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)； 7. 電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。

26、,1. 將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。 2. 負(fù)離子分析時(shí)，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽(yáng)極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)。,五、毛細(xì)管等速電泳 Capillary isotachophoresis ，CITP,3. 不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度不同(=E)，淌度大的離子區(qū)帶電場(chǎng)強(qiáng)度小； 沿出口到進(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4 電場(chǎng)強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號(hào)中離子擴(kuò)散到“3”號(hào)，該區(qū)電場(chǎng)強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)

27、；當(dāng)“2”號(hào)中離子跑到“1”號(hào)區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)； 4. 特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用；,capillary isotachophoresis ，CITP,在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以“電滲泵”取代機(jī)械泵，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過(guò)程。,六、毛細(xì)管電動(dòng)色譜 Capillary electrokinetic chromatography ，CEC,七、毛細(xì)管微乳電動(dòng)色譜(Microemulsion electrokinetic chromatography, MEEKC),CE相關(guān)技術(shù) 1.毛細(xì)管電泳柱技術(shù) 毛細(xì)管是CE的核心部件之一早期研究集中在毛細(xì)管

28、直徑、長(zhǎng)度、形狀和材料方面，目前集中在管壁的改性和各種柱的制備。,1) 動(dòng)態(tài)修飾毛細(xì)管內(nèi)壁 管壁改性主要是消除吸附和控制電滲流，通常采用動(dòng)態(tài)修飾和表面涂層兩類方法。動(dòng)態(tài)修飾采用在運(yùn)行緩沖液中加入添加劑，如加入陽(yáng)離子表面活性劑十四烷基三甲基溴化銨(TTAB)，能在內(nèi)壁形成物理吸附層，使EOF反向添加劑還有聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)等，甲基纖維素(MC)可形成一中性親水性覆蓋層。,2) 毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂層 涂層方法有很多種，包括物理涂布、化學(xué)涂層。最常用的方法是采用雙官能團(tuán)的偶聯(lián)劑，如各種有機(jī)硅烷，第一個(gè)官能團(tuán)(如甲氧基)與管壁上的游離羥基進(jìn)行反應(yīng)，使其與管壁進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，再用第二個(gè)官能團(tuán)(如乙烯

29、基)與涂漬物(如聚丙烯酰胺)進(jìn)行反應(yīng)，形成一穩(wěn)定的涂層此外還有將纖維素、PEI和聚醚組成多層涂層，親水性的絨毛涂層(fuzzy)和聯(lián)鎖聚醚涂層。,化學(xué)鍵合,物理吸附,3) 凝膠柱和無(wú)膠篩分 CGE的關(guān)鍵是毛細(xì)管凝膠柱的制備，常用聚丙烯酰胺凝膠栓來(lái)進(jìn)行DNA片段分析和測(cè)序。測(cè)定蛋白質(zhì)和肽的分子量常用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳(SDS-LPAGE)。如將聚丙烯胺單體溶液中的交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)濃度降為零，得到線性非交聯(lián)的親水性聚合物用作操作溶液，仍有按分子大小分離的作用，稱無(wú)膠篩分。此法簡(jiǎn)單，使用方便，分離能力比CGE差。,4) CEC的毛細(xì)管柱制備 包括開(kāi)管和填充柱 開(kāi)管柱：鍵合色譜

30、涂層毛細(xì)管柱，例如：將核糖核酸酶、己糖激酶、腺苷脫氨酶等固定到毛細(xì)管表面，構(gòu)成一開(kāi)管反應(yīng)器，再和CE連接，可進(jìn)行核酸選擇性檢測(cè)、微量在線合成和分離寡核昔酸等工作。 填充柱：可將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細(xì)管中。,2.毛細(xì)管電泳檢測(cè)技術(shù) CE對(duì)檢測(cè)器靈敏度要求相當(dāng)高，故檢測(cè)是CE中的關(guān)鍵問(wèn)題。迄今為止除了原子吸收光譜與紅外光譜末用于CE外，其它檢測(cè)手段均已用于CE?，F(xiàn)選擇重要的幾類檢測(cè)器介紹其最新進(jìn)展。,1) 紫外檢測(cè)器(UV) 在合適位置除去涂層，將透明部分對(duì)準(zhǔn)光路。 UV檢測(cè)器集中在提高靈敏度，可采用毛細(xì)管彎折、吹泡技術(shù)擴(kuò)大光路?；虿捎闷矫娣e分檢測(cè)池，這種設(shè)計(jì)可使檢測(cè)光路增加到1cm

31、。也有用光散射二極管(LEDS)作光源，其線性范圍和信噪比優(yōu)于汞燈?？傮w來(lái)說(shuō)進(jìn)展不大。,2) 激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)LIF LIF是CE最靈敏的檢測(cè)器之一，極大地拓展了CE的應(yīng)用，DNA測(cè)序就須用LIF，單細(xì)胞和單分子檢測(cè)也離不開(kāi)LIF。利用CE-LIF技術(shù)可檢出染色的單個(gè)DNA分子，有望用于癌癥的早期診斷及臨床酶和免疫學(xué)檢測(cè)等。CELIF和微透析結(jié)合可測(cè)定腦中神經(jīng)肽。采用波長(zhǎng)分辨熒光檢測(cè)器可提供有關(guān)蛋白和DNA序列的一些結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)信息。一些適用于二極管激光器的熒光標(biāo)記試劑如CY5等，正在不斷開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。,CE/LIF向三個(gè)方向發(fā)展：在原有氦鎘激光器(325nm)和氬離子激光器(488nm)之外，發(fā)

32、展價(jià)廉、長(zhǎng)波長(zhǎng)的二極管激光器；發(fā)展更多的熒光標(biāo)記試劑來(lái)擴(kuò)展應(yīng)用面；開(kāi)展更多的應(yīng)用研究。 LIF不但提高了靈敏度，也可增加選擇性，缺點(diǎn)在于被測(cè)物須用熒光試劑標(biāo)記成染色。,3). CE/MS聯(lián)用 CE/MS聯(lián)用,彌補(bǔ)了CE定性鑒定的不足，故發(fā)展特別快。 CE/MS聯(lián)用主要在兩方面發(fā)展：一是各種CE模式和MS聯(lián)用，二是CE和各種MS聯(lián)用。關(guān)鍵是解決接口裝置。最早報(bào)道CE/MS聯(lián)用是采用單級(jí)四極桿質(zhì)譜，現(xiàn)已發(fā)展到三級(jí)四極質(zhì)譜、離子阱質(zhì)譜等。CE/MS聯(lián)用特別適合于復(fù)雜生物體系的分離鑒定。因所需樣品少，目前大部分工作集中在基因工程產(chǎn)品和蛋白樣品，CE/MS聯(lián)用現(xiàn)在已成為CE研究中的熱點(diǎn)。,4) 電化學(xué)檢

33、測(cè)器（EC） EC可避免光學(xué)類檢測(cè)器遇到的光程太短的問(wèn)題，故和LIF同為CE中靈敏度最高的檢測(cè)器。報(bào)道最多的是電化學(xué)伏安檢測(cè)器，常用碳纖維微電極進(jìn)行單細(xì)胞極微量神經(jīng)遞質(zhì)(如多巴胺等)的測(cè)定?？捎妹}沖伏安法測(cè)定糖、糖肽及金屬離子，也可用循環(huán)伏安法，另一類常用的EC為電導(dǎo)檢測(cè)器，Li的檢測(cè)限達(dá)10-7mol/L(10-15mol)。,5) 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(CL) CL具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、靈敏度高的特點(diǎn)，近年來(lái)引起重視。用CECL檢測(cè)血紅蛋白，其檢測(cè)限比CEUV低約4個(gè)數(shù)量級(jí)。應(yīng)用最多的仍是魯米那(luminol)體系，因?yàn)樵擉w系對(duì)多數(shù)待測(cè)物如一些金屬離子、氨基酸及其衍生物的檢測(cè)靈敏度很高，且反應(yīng)在水相進(jìn)

34、行。電致化學(xué)發(fā)光(ECL)也已成功地用作CE檢測(cè)。,第六章 檢測(cè)器選擇,小分子檢測(cè) 大分子檢測(cè),CE檢測(cè)器種類及性能,小分子檢測(cè),有紫外吸收 首先選擇二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器 無(wú)紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，如氨基酸、還原性糖等 不可以衍生化的，可采用間接紫外法用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，也可以嘗試電化學(xué)檢測(cè)器 有熒光或需要高靈敏度檢測(cè)的可采用LIF檢測(cè)器 需要測(cè)定結(jié)構(gòu)或者難以用光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)的，可以考慮質(zhì)譜檢測(cè),大分子檢測(cè),蛋白、核酸 可以首先選擇紫外檢測(cè)器 如果需要高靈敏度檢測(cè)可以采用柱前或者柱上衍生的方法標(biāo)記熒光，然后用LIF檢測(cè) 如果需要特異性檢測(cè)，可使用

35、特異性熒光探針，標(biāo)記后再LIF檢測(cè) 需要測(cè)定分子量或氨基酸序列，可采用質(zhì)譜檢測(cè) 多糖 含量較高的多糖可以采用末端吸收法以紫外檢測(cè)器檢測(cè) 含量較低的還原性多糖可用衍生試劑標(biāo)記后以LIF、UV的方式檢測(cè),分離條件選擇流程,分離條件的選擇是毛細(xì)管電泳中最重要但也是最難之處。不同的專業(yè)研究工作者可能會(huì)有各自不同的選擇策略和流程，我們提出如下九步選擇流程，僅供參考： 第一步，盡可能多地了解分離樣品的類型、來(lái)源、組成及其性質(zhì)； 第二步，根據(jù)樣品的可能性質(zhì)和來(lái)源，選擇分離模式，若無(wú)樣品信息可先選CZE；,第三步，根據(jù)樣品性質(zhì)確定檢測(cè)方法，一般先選直接紫外吸收； 第四步，確定樣品處理方式，包括衍生方案以及離心過(guò)濾除蛋白等； 第五步，根據(jù)樣品解離常數(shù)計(jì)算最佳pH，或利用75mID毛細(xì)管和磷酸緩沖體系確定pH范圍;,第六步，根據(jù)所需pH構(gòu)建緩沖體系，包括進(jìn)一步優(yōu)化pH、緩沖試劑濃度等； 第七步，優(yōu)化其他操作參數(shù)，如毛細(xì)管