11research development免疫學檢測技術(shù).ppt

1、免疫學實驗技術(shù),Immunological experiment technique,一、免疫細胞分離與功能測定技術(shù) 1.免疫細胞分離與純化 2.免疫細胞功能測定,二、免疫分子的檢測技術(shù) 1.細胞膜分子 2.可溶性分子,1.免疫細胞分離與純化 (B細胞、T細胞、NK細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、DC、紅細胞等) 2.免疫細胞功能測定,一、免疫細胞分離與功能測定技術(shù),1）單個核細胞分離 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法 Percoll不連續(xù)密度梯度離心法,除去,分離,1、免疫細胞分離與功能測定,1）單個核細胞分離,多次洗滌除去血小板 低滲或氯化銨溶解紅細胞 黏附除去單核細胞 L亮酸甲酯除去單核細胞、

2、NK、Tc 集團鐵除去單核細胞 免疫吸附分離除去單核細胞 免疫磁珠分離除去單核細胞,2）淋巴細胞純化,尼龍棉柱分離,6mm,T細胞,B 細 胞,3）B細胞、T細胞分離,E花環(huán)分離,3）B細胞、T細胞分離,免疫吸附分離,羊抗鼠Ab,3）B細胞、T細胞分離,B,B,B,免疫磁珠分離法,免疫磁珠法分離細胞 細胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細胞得以分離。,免疫磁珠分離法,免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法： 陽性分離法磁珠結(jié)合的細胞就是所

3、要分離獲得的細胞 陰性分離法磁珠結(jié)合不需要的細胞，游離細胞為所需細胞 一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。,磁珠分離細胞的重要指標是： 純度和得率：取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大?。ù判裕?，然而太大的磁珠會影響細胞活性。目前市場上有2種磁性細胞分離系統(tǒng)：* Small particles (50 nm) MACS* Large particles (12004500 nm) others（如Dynal）,小磁珠 優(yōu)點：分離后續(xù)培養(yǎng)、 可上流式檢測 缺點：強的磁場、 速度慢得率低、 成本昂貴大磁珠 優(yōu)點：試管中完成（簡單）、易于增減細胞用量、速度快得率高、

4、成本低； 缺點：影響細胞活性不利于培養(yǎng)、純度低、容易阻塞FCM的噴嘴；,優(yōu)點與缺點, flow cytometry, T細胞增生(轉(zhuǎn)化)試驗 T細胞介導的細胞毒試驗原理 T細胞功能的體內(nèi)檢測法 流式細胞術(shù) T分泌細胞因子功能測定,4）T細胞功能測定, T分泌細胞因子功能測定, T分泌細胞因子功能測定, T分泌細胞因子功能測定, T分泌細胞因子功能測定, B細胞轉(zhuǎn)化試驗 溶血空斑形成試驗 反向溶血空斑試驗 酶聯(lián)免疫斑點法,5）B細胞功能測定, 酶聯(lián)免疫斑點法, 酶聯(lián)免疫斑點法, 酶聯(lián)免疫斑點法, 酶聯(lián)免疫斑點法,1)形態(tài)學檢查法 2) 51Cr放射性核素釋放法 3)酶釋放法： 4)化學發(fā)光法 5

5、)流式細胞術(shù),6）NK細胞活性測定,51Cr放射性核素釋放法,6）NK細胞活性測定,1)中性粒細胞趨化功能測定 2)中性粒細胞吞噬功能測定,7）吞噬細胞功能測定,3)巨噬細胞吞噬功能測定 4)巨噬細胞胞毒作用,7）吞噬細胞功能測定,8）DC分離與純化,分離DC的原理是依據(jù)樹突狀細胞的低密度和半粘附特性:具有輕度暫時性粘附特性-從而可以和其他非粘附細胞、巨噬細胞；,8）DC分離與純化,小鼠脾臟DC是1974年首次分離獲得的：利用DC半粘附性將脾臟內(nèi)單個核細胞培養(yǎng)3小時后，洗去非粘附細胞（淋巴細胞），純度約為40%-60%； 采用培養(yǎng)板親和粘附提高了DC的純度80-90%，操作方便、花費小、但提取

6、的量較少；,8）DC分離與純化,免疫磁珠法分離（CD11c） 分離誘生法:主要是采用直接分離和細胞因子誘生相結(jié)合的方法,依次去除紅細胞、T、B細胞、粒細胞、單核-巨噬細胞等而獲得純化樹突狀細胞及其前體，再聯(lián)合細胞因子誘導下培養(yǎng)； 應用細胞因子誘導人體CD34 細胞定向分化為樹突狀細胞近年來已有大量文獻報道；,9）紅細胞功能測定,1930年Duke和Wallace發(fā)現(xiàn)錐蟲在抗血清及補體參與下，可黏附到人類紅細胞膜上，并發(fā)現(xiàn)不同人紅細胞對錐蟲的黏附能力不同，推測在紅細胞膜上存在者一種與免疫有關的物質(zhì)。1953年Nelson報道，型肺炎雙球菌可以被補體調(diào)理結(jié)合到人紅細胞膜上，此現(xiàn)象稱為免疫黏附，這種

7、黏附需激活補體C3，而不需要激活下游的補體成分，認為紅細胞膜上可能存在免疫黏附受體。,9）紅細胞功能測定,直到1963年Nishioka證實這種免疫黏附現(xiàn)象是通過人紅細胞膜補體C3受體(現(xiàn)稱CRl或 CD35)而實現(xiàn)的。1980年Fearon詳細研究CD35性質(zhì)，表明85%的CD35存在紅細胞膜上。1981年Siegel在前人研究的基礎上發(fā)現(xiàn)紅細胞可黏附腫瘤細胞、血清中存在抑制紅細胞黏附因子、紅細胞膜上過氧化物酶活性與CD35活性相關等多種免疫功能，提出了“紅細胞免疫系統(tǒng)”的概念， 1982年在開展紅細胞免疫的研究；,10）干細胞分離與鑒定,1.細胞膜分子：黏附分子、受體、配體、胞漿蛋白等細胞

8、成分； 免疫標記技術(shù) 2.可溶性分子：Ig、細胞因子、可溶性黏附分子、可溶性受體、細胞分泌的各種分子等等 免疫標記技術(shù) 生物學活性測定（IL-2等） 分子生物學測定（mRNA等）,二、免疫分子的檢測技術(shù),免疫標記技術(shù),免疫標記技術(shù),標記免疫學創(chuàng)立于60年代初期，開始以放射免疫分析為代表，以后相繼派生出許多其它的標記免疫分析方法。 60年代末期創(chuàng)立了免疫放射分析，其靈敏度、特異性、線性范圍均好。 70年代初建立.酶標記免疫分析，價格低，檢測方便，無放射性污染。 70年代中期，發(fā)光信號進行酶免分析建立，靈敏度高，快速。,1.標記免疫分析的發(fā)展過程, 90年代中期發(fā)展起全自動的化學發(fā)光免疫分析儀。

9、80年代初期時間分辨熒光免疫分析問世，已經(jīng)顯示出其良好的發(fā)展前景。用時間分辨技術(shù)(波長和時間兩種分辨)測量熒光，有效地排除非特異熒光，大大地提高了分析的靈敏度，穩(wěn)定性好，有效期長，測量速度快，易于自動化，因此被公認為有良好發(fā)展前景的非放射性標記免疫分析方法之。 重點：提高靈敏度和特異性兩大問題。,1.標記免疫分析的發(fā)展過程,2.標記免疫分析的分類1,標記免疫分析的基本原理： 按照示蹤標記物及標記技術(shù)分類： 1放射性元素標記免疫分析 2酶標記免疫分析 3熒光標記免疫分析 4金銀標記免疫分析 5. 化學發(fā)光免疫分析,2.標記免疫分析的分類1,2.標記免疫分析的分類2,按反應體系的物理狀態(tài)分類： 1

10、. 均相標記免疫分析 2. 非均相標記免疫分析 放射性核素分析 酶標記免疫分析 熒光標記免疫分析 化學發(fā)光免疫分析 電化學發(fā)光免疫分析 按照檢測對象不同進行分類講解：,免疫細胞化學技術(shù),一.免疫熒光細胞化學技術(shù)-常用熒光素,1.常用熒光素 異硫氰酸熒光素(FITC)：呈黃綠色 四乙基羅丹明(RB200)：呈橙紅色，熒光效率較低。 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)：橙紅色熒光，與FITC的黃綠色熒光對比清晰，常用于雙標記示蹤。 藻紅蛋白(phycoerythfin，PK)：在流式細胞術(shù)(FCM)中較常用。 7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methylcoumarin，AMC)：用

11、于雙標記或多標記。,Cell Ag,一.免疫熒光組織化學技術(shù)-常用方法1,1).直接法 熒光素標記抗體-抗原,一.免疫熒光組織化學技術(shù)-常用方法2,Cell Ag,2).間接法 抗原-已知未標記抗體-熒光素標記的抗抗體,一.免疫熒光組織化學技術(shù)-常用方法3,Cell Ag,補體,3).補體法 直接法 間接法 切片中抗原抗體與補體混合液熒光素標記抗補體,4).雙重免疫熒光染色法 可在同一標本上定位、定性檢測兩種抗原。如A抗原的抗體用羅達明(RB200)標記，呈桔紅色，而B抗原的抗體用FITC標記呈黃綠色，鏡下兩種不同激發(fā)光，就可以檢測不同的抗原成分。 常用下列染色法： 一步雙染色法： 二步雙染色

12、法：,一.免疫熒光組織化學技術(shù)-常用方法4,一.免疫熒光組織化學技術(shù)-常用方法4,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,酶標記法：酶交聯(lián)結(jié)合在抗體上，形成酶標記抗體 非標記抗體技術(shù)：酶作為抗原與相應特異性抗體連接,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,1.常用酶 辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)：底物為H202，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、ABTS為供氫體的反應產(chǎn)物可觀察或進行比色測定。 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)： 底物為對硝基苯磷酸鹽(PNP)、-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯等。 葡萄糖氧化酶(gucos

13、e oxidase，GOD)：葡萄糖為底物的酶，供氫體為對硝基藍四氮唑(nitroblue tetrazolium，NBT)，酶促反應的終產(chǎn)物為不溶性的藍色沉淀，比較穩(wěn)定。,二.免疫酶組化技術(shù)-常用酶,過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物 (peroxidase-anti peroxidase,PAP) 堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶復合物 (alkaline phasphatase-antialkaline phasphatase, APAAP),酶標記抗體免疫組化常用方法1,1).直接法 酶標記抗體與組織細胞內(nèi)相應抗原反應,酶標記抗體免疫組化常用方法2,人Cell Ag,底物,2).間接法 抗原抗體酶標

14、抗抗體復合物，通過酶底物顯色。,酶標記抗體免疫組化常用方法3,人Cell Ag,底物,3).酶標抗體三步染色法 由于酶分子的增加，增強了方法的敏感性。,非標記抗體免疫酶組化常用方法1,1).酶橋法 靶抗原特異性抗體(如兔抗人)- 二抗即橋抗體(如羊抗兔)抗酶抗體(如兔抗酶)酶液顯色。,人Cell Ag,底物,非標記抗體免疫酶組化常用方法2,2).PAP法 靶抗原特異性抗體(如兔抗人)過量橋聯(lián)抗體(如羊抗兔)PAP復合物(如兔PAP)底物顯色。,人Cell Ag,兔抗人Ab,羊抗兔Ab,3).APAAP法 靶抗原抗體(如兔抗人)二抗即橋聯(lián)抗體(如羊抗兔)復合物(如兔 APAAP)底物顯色。,人C

15、ell Ag,非標記抗體免疫酶組化常用方法3,4).雙PAP法,人Cell Ag,非標記抗體免疫酶組化常用方法4,三.親合免疫組織化學技術(shù)常用方法,1.生物素-親合素技術(shù) 1).親合素生物素過氧化物酶技術(shù)(avidin biotin-pemxidase complex technique，簡稱ABC技術(shù)) ABC系統(tǒng)廣泛應用于免疫學檢測技術(shù)。 2).橋聯(lián)親合素生物素技術(shù)(Bridged Avidin-Biotin technique，BRAB技術(shù)) 3).標記親合素生物素技術(shù)(Labelled Avidin-Biotin technique，LAB技術(shù)) 2.葡萄球菌A蛋白(SPA) 3.凝集

16、素 1).直接法 2).間接法 3).糖凝集素糖法 4.鏈霉親合素生物素技術(shù)(labelled streptavidin biotinmethod，LSAB):,三.親合免疫組織化學技術(shù)常用方法,ABC法：人組織標本靶抗原第一抗體(如鼠抗人)生物素標記的第二抗體(如biotin羊抗鼠)等量的親合素和酶標生物素混合液底物顯色。,人Cell Ag,四.免疫金銀及鐵標記免疫組化技術(shù),人組織標本靶抗原-抗體(如兔抗人)-金標二抗(如金標羊抗兔)-金顆粒呈紅色（銀顯影液作用后銀顆粒呈棕黑色、膠體鐵通過普魯藍反應呈藍色）,人Cell Ag,兔抗人Ab,金,羊抗兔Ab,人Cell Ag, ,免疫標記測定技術(shù)

17、,1.熒光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA) 2.均相熒光免疫分析(homogeneous fluorescence immunoassay) 熒光激發(fā)傳遞免疫分析法(fluorescence excitation transfer immunoassay) 已用于嗎啡和IgG等的定量測定。,一、熒光免疫測定技術(shù),熒光猝滅免疫測定法(fluorescence quenching immunoassay) 粒子濃縮熒光免疫分析 (particle concentration fluorescence immunoassay，PCF

18、IA) 時間分辨熒光免疫測定(time-resolved fluoro-immunoassay，TrFIA) 熒光激活細胞分類儀：流式細胞術(shù),一、熒光免疫測定技術(shù),熒光偏振免疫分析儀,流式細胞儀,二.放射免疫分析,1.放射免疫測定(radioimmunoassay，RIA)原理：標記抗原和未標記待測抗原對有限量抗體的競爭性結(jié)合(或競爭性抑制)反應。,有限的Ab,二.放射免疫分析,2.放射受體分析(radioreceptor assay，RRA)原理：與免疫放射測定相似。用于測定受體的親和常數(shù)、解離常數(shù)、受體結(jié)合數(shù)以及定位分析等。 3.免疫放射測定(immunoradioimetric assa

19、y IRMA)原理:待測抗原與過量標記抗體的非競爭結(jié)合反應，然后加入固相的抗原免疫吸附劑以結(jié)合游離的標記抗體，離心除去沉淀，測定上清液中放射性強度，從而推算出檢晶中抗原含量,三.酶免疫測定(enzyme immunoassay，EIA),酶免疫測定分類： 非均相酶免疫測定(heterogeneous enzyme immunoassay) 均相酶免疫測定(homogeneous enzyme immunoassay) 常用標記酶：HRP、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。,三.酶免疫測定(enzyme immunoassay，EIA),非均相酶免疫測定(heterogeneous enzyme im

20、munoassay)是目前應用最廣泛，又分為： 固相酶免疫測定： 瓊脂糖珠(Sepharose 4B)作為載體的DASS體系 聚苯乙烯及其他固相支持物的酶聯(lián)免疫吸附試驗 液相酶免疫測定,1.固相酶免疫測定常用方法1,(1)間接法：已知抗原吸附固相載體-待檢抗體-洗滌-酶標抗抗體-底物顯色-目測或酶標儀測光密度值定量測定,1.固相酶免疫測定常用方法2,(2)雙抗體夾心法：已知抗體吸附固相載體-待檢抗原-洗滌-酶標抗體-底物顯色,1.固相酶免疫測定常用方法3,(3)競爭法： 測定抗原： 測定抗體：,1.固相酶免疫測定常用方法4,(4)MAC-ELISA：捕獲法測IgM的酶聯(lián)免疫吸附試驗(簡稱MAC

21、-ELISA)，抗人IgM(鏈)抗體包被固相載體-待檢血清IgM-洗滌-特異性抗原-酶標抗體-底物顯色,底物,1.固相酶免疫測定常用方法5,(5)斑點ELISA(dot-ELISA) 吸附蛋白質(zhì)能力強的硝酸纖維素膜(NC膜)為載體，進行間接法或夾心法，呈色斑點，常用于篩選單克隆抗體雜交瘤細胞；在各種病毒性疾病和寄生蟲病的臨床診斷與血清流行病學調(diào)查中亦廣泛使用。,雜交瘤細胞,(6)ABC法,NC膜,1.固相酶免疫測定常用方法7,(7)免疫印記,能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量，常用于檢測多種病毒的抗體或抗原，如抗HIV抗體的檢測。,2.液相酶免疫測定,液相酶免疫測定 在液相中進行的抗原抗體反應達到平衡后，需加分離劑將游離的酶標記物分離，然后再加底物顯色測定。分為平衡法和非