基礎(chǔ)生物化學(xué)-蛋白質(zhì)

1、2 蛋白質(zhì)（Protein）化學(xué) 2.1 氨基酸化學(xué) 2.2 肽 2.3 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 2.5 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì),1902年Emil Fisher證明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是多肽,蛋白質(zhì)簡(jiǎn)述,蛋白質(zhì)是由20種L-氨基酸縮合而成的長(zhǎng)鏈分子。 蛋白質(zhì)是細(xì)胞中含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子。幾乎參與所有的生命活動(dòng)和生命過(guò)程。因此研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是生命科學(xué)最基本的課題。,蛋白質(zhì)的功能 催化作用 結(jié)構(gòu)組成 代謝調(diào)節(jié) 細(xì)胞運(yùn)動(dòng) 保護(hù)作用 物質(zhì)運(yùn)輸 細(xì)胞通訊 蛋白貯藏 其他,蛋白質(zhì)的化學(xué)組成 組成蛋白質(zhì)的元素 組成蛋白質(zhì)的元素有：C、H、O、N和S C：50% H：7% O

2、：23% N：16 % S：0-3% 其它(P、Mo、Fe等) 微量 蛋白N平均含量為16%的特點(diǎn)作為凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的計(jì)算依據(jù)。 蛋白質(zhì)含量 = 蛋白N含量6.25,蛋白質(zhì)的組成單位-氨基酸 在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的氨基酸有200多種，而參與組成蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)氨基酸） 的有20種基本氨基酸。 氨基酸殘基的估算法：分子量/110,2.1 氨基酸(Amino acid, AA) 2.1.1 組成蛋白質(zhì)氨基酸的結(jié)構(gòu)及分類(lèi) 2.1.1.1 組成蛋白質(zhì)氨基酸的共同特點(diǎn) 組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸均為-AA。 通式,除Gly外，其它AA的-碳原子均為不對(duì)稱(chēng)碳原子，因而均有兩種不同的空間構(gòu)型：L-型（左）和

3、D-型（右），二者互為對(duì)映體。,L丙氨酸 D丙氨酸 D甘油醛,除Gly外，其它AA都具有旋光性，能使偏振光的偏振面向左（-）或向（+）旋轉(zhuǎn)。 20種AA在結(jié)構(gòu)上的差異取決于側(cè)鏈基團(tuán)R的不同。,2.2.1.2 氨基酸的種類(lèi)和結(jié)構(gòu) 按R基的極性分 非極性AA（8種）:Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp; 極性AA(12種)： R-基不帶電荷的AA（中性Aa）：Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr R-基帶正電荷的AA（堿性Aa）：Lys、Arg、His R-基帶負(fù)電荷的AA（酸性Aa）：Glu, Asp,據(jù)R基的結(jié)構(gòu)可分 脂肪族氨基酸 含一氨基一羧基的

4、中性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile 含羥基氨基酸：Ser、Thr 含硫氨基酸 ：Cys、Met 含酰胺基氨基酸 ：Asn、Gln 含一氨基二羧基的酸性氨基酸：Asp、Glu 含二氨基一羧基的堿性氨基酸：Lys、Arg 芳香族氨基酸： Phe、Tyr 雜環(huán)族氨基酸：Trp、His、Pro,丙氨酸（Ala，A）,纈氨酸（Val，V）,亮氨酸（Leu，L）,異亮氨酸（Ile，I）,脯氨酸（Pro，P）,苯丙氨酸（Phe，F(xiàn)）,色氨酸（Trp，W）,蛋氨酸 或 甲硫氨酸（Met，M）,甘氨酸（Gly，G）,絲氨酸（Ser，S）,蘇氨酸（Thr，T）,半胱氨酸（Cys，C）,天冬酰胺（A

5、sn，N）,谷氨酰胺（Gln，Q）,酪氨酸（Tyr，Y）,賴(lài)氨酸（Lys，K）,精氨酸（Arg，R）,組氨酸（His，H）,谷氨酸（Glu，E）,天冬氨酸（Asp，D）,有些蛋白質(zhì)中還含有其它氨基酸，這是在蛋白質(zhì)生物合成之后，相應(yīng)的氨基酸殘基被修飾形成的。,2.1.2 氨基酸的理化性質(zhì) 2.1.2.1一般物理性質(zhì) 1、溶解度 - AA一般為白色結(jié)晶，且每一種的結(jié)晶形狀不一，大多AA能溶于水，少數(shù)（Cys、Tyr、Asp、Gly）難溶于水；所有AA均能溶于酸、堿中，不溶于乙醚、酒精（脯、羥脯除外）有機(jī)溶劑。,2、光吸收 組成蛋白質(zhì)的20種AA均不吸收可見(jiàn)光，在近紫外光區(qū)（220nm300nm）T

6、yr、Trp、Phe有吸收光的能力，其吸收峰和摩爾消光系數(shù)為： Tyr max=275nm 275=1.4103 Phe max=257nm 257= 2102 Trp max=280nm 280=5.6103,光吸收測(cè)定,2.1.2.2 氨基酸的化學(xué)性質(zhì) 1、兩性解離和等電點(diǎn) AA的兩性解離,酸性溶液中的AA 水溶液中的AA 堿性溶液中的AA （陽(yáng)離子） （兼性離子） （陰離子）,等電點(diǎn)（isoelectric point) 在一定pH值時(shí)，AA以兼性離子存在，在電場(chǎng)中不會(huì)向正、負(fù)極移動(dòng)，此時(shí)的pH值稱(chēng)氨基酸的等電點(diǎn)（pI）。 pI= 1/2 (pK1 +pK2) 酸性Aa pI= 1/2(

7、pK1 +pKR) 堿性Aa pI= 1/2(pK2 +pKR),K2 =R-H+/R0,K1 =R0H+/R+,K1 K2 =H+2R-/R+ 等電點(diǎn)時(shí)R-=R+， 則：H+ =I = (K1 K2)1/2， 兩邊取負(fù)對(duì)數(shù)得：pI=1/2(p K1 +p K2 ),K1 和 K2 分別代表-C上的-COOH和-NH3+的表觀解離常數(shù)，如果側(cè)鏈R基上有可解離的基團(tuán)，用K R 表示其表觀解離常數(shù)。 表觀解離常數(shù)可用測(cè)定滴定曲線方法求得。當(dāng)1mol甘氨酸溶于水時(shí)，溶液的pH值約為6，分別用標(biāo)準(zhǔn)NaOH和HCl進(jìn)行滴定，以酸或堿的用量對(duì)pH值作圖，可得到一條曲線B和A。,曲線B在pH=9.6處有一拐

8、點(diǎn)，根據(jù)解離公式，R0=R-時(shí)， K2=H+，即pK2 =pH。 曲線A在pH=2.34處有一拐點(diǎn)，根據(jù)解離公式，R0=R+時(shí)， K1=H+，即pK1 =pH。,等電點(diǎn)時(shí)，Glu主要以兼性離子(R0)存在，R+和R-很小而且相等，R2-的量可忽略不計(jì)。因此 pI=1/2(pK1+pKR),帶有可解離R基的氨基酸有3個(gè)pK,等電點(diǎn)時(shí)，Lys主要以兼性離子(R0)存在，R2+的影響極小。因此 pI=1/2(pK2+pKR),2、氨基酸的重要化學(xué)反應(yīng) 與茚三酮反應(yīng)：氨基酸脫羧脫氨被氧化，水合茚三酮被還原，氧化型和還原型的水合茚三酮與氨反應(yīng)生成二酮茚-二酮茚胺的取代鹽等藍(lán)紫色化合物。,水合茚三酮 還原

9、型水合茚三酮,藍(lán)紫色物質(zhì),Sanger反應(yīng)在弱堿溶液中AA與2,4-二硝基氟苯（FDNB）反應(yīng)，生成黃色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA），Sanger首先用此反應(yīng)鑒定多肽鏈或蛋白質(zhì)的NH2末端氨基酸。, Edman反應(yīng)；在弱堿條件下AA與異硫氰酸苯酯（PITC）反應(yīng)生成苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物，生成的衍生物可通過(guò)層析法分離鑒定，Edman首先用此反應(yīng)鑒定多肽的N-端AA。,異硫氰酸苯酯,苯氨基硫甲酰衍生物 苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物 （PTC-氨基酸） （PTH-氨基酸）,2.2 肽(peptide) 2.2.1 肽和肽鏈的結(jié)構(gòu)即命名 氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水形成肽。肽鍵是蛋白質(zhì)分子中氨基酸

10、連接的基本方式。肽鍵相連構(gòu)成了蛋白質(zhì)的主鏈。,肽 氨基酸之間通過(guò)肽鍵聯(lián)結(jié)起來(lái)的化合物稱(chēng)為肽。兩個(gè)氨基酸形成的肽叫二肽，三個(gè)氨基酸形成的肽叫三肽，十個(gè)氨基酸形成的肽叫十肽，一般將十肽以下稱(chēng)為寡肽(oligopeptide)，以上者稱(chēng)多肽(polypeptide)或稱(chēng)多肽鏈。 氨基酸殘基(amino acid residues ) 肽鏈中的氨基酸在參加肽鍵形成時(shí)失去了1分子水，已經(jīng)不是原來(lái)完整的分子，稱(chēng)為氨基酸殘基。,命名及書(shū)寫(xiě)方式 一條肽鏈通常含有一個(gè)游離的-氨基端(N-末端)和一個(gè)游離的-羧基端(C-末端)。 規(guī)定肽鏈的氨基酸排列順序從其N(xiāo)-末端開(kāi)始，到C-末端終止。常把N-末端氨基酸殘基放在

11、左邊，C-末端氨基酸殘基放在右邊。 小分子肽一般按其氨基酸殘基排列順序命名，如：Tyr-Gly-Gly-Phe-Met稱(chēng)為：酪氨酰甘氨酰甘氨酰苯丙氨酰蛋氨酸（腦啡肽）。,二硫鍵 連接氨基酸殘基的共價(jià)鍵除肽鍵外，兩個(gè)Cys殘基的側(cè)鏈之間可形成二硫鍵(disulfide bond)，即胱氨酸殘基中的二硫鍵，又稱(chēng)二硫橋(disulfide bridge)。它可使兩條單獨(dú)的肽鏈共價(jià)交聯(lián)起來(lái)(鏈間二硫鍵)，或使一條鏈的某一部分形成環(huán)(鏈內(nèi)二硫鍵)。,2.2.2 重要的天然活性肽 生物體內(nèi)存在很多游離的活性肽（active peptide），它們具有特殊的生物學(xué)功能。如：催產(chǎn)素、加壓素和舒緩激肽、生長(zhǎng)激素

12、釋放因子、谷胱甘肽等，腦啡肽（5肽）近年來(lái)引起人們的關(guān)注，它們?cè)谥袠猩窠?jīng)中形成，是體內(nèi)產(chǎn)生的一類(lèi)鴉片劑。,牛催產(chǎn)素,催產(chǎn)素：8肽，能使多種平滑肌收縮，具有催產(chǎn)及使乳腺排乳的作用。,加壓素：8肽，可使小動(dòng)脈收縮，從而增高血壓，并有減少排尿的作用。,牛加壓素,動(dòng)植物細(xì)胞中的還原型谷胱甘肽，可作為某些氧化還原酶的輔酶，在細(xì)胞中作為巰基緩沖劑，維持細(xì)胞蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基處于還原態(tài)。,還原型谷胱甘肽 （GSH）,氧化型谷胱甘肽 （GSSG）,某些抗生素也是肽或肽衍生物，如：短桿菌肽S（環(huán)10肽），放線菌素D和多粘菌素E等。,2.3 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)具有三維空間結(jié)構(gòu)，執(zhí)行復(fù)雜的生物學(xué)功能，結(jié)構(gòu)與

13、功能之間的密切關(guān)系。 天然蛋白質(zhì)各有其特殊的生物學(xué)活性，肽鏈的氨基酸序列決定了每一種蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，由于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸各具特殊的側(cè)鏈，側(cè)鏈基團(tuán)的理化性質(zhì)和空間排布各不相同，當(dāng)它們按照不同的序列關(guān)系組合時(shí)，就可形成多種多樣的空間結(jié)構(gòu)和不同生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)分子。,為了研究方便，將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為一級(jí)結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和四級(jí)結(jié)構(gòu)4個(gè)層次，同時(shí)在二、三級(jí)結(jié)構(gòu)間又劃分出超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域。,2.3.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序。,1953年英國(guó)Sanger等人，完成了牛胰島素(Isulin)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定工作，分子量為5700D，有A鏈

14、(21AA)和B鏈(30AA)兩條肽鏈，兩個(gè)鏈間有二硫鍵和一個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(A鏈)。,1960年Stanford Moore等完成了牛胰核糖核酸酶(RNase)的分析， RNase由一條含124個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成，分子內(nèi)含有4個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵，分子量為12600。它是水解核糖核酸磷酸二酯鍵的酶。,2.3.2 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure) 多肽鏈(polypeptide chain)多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。,2.3.2.1 蛋白質(zhì)的構(gòu)象和維持構(gòu)象的作用力 蛋白質(zhì)的構(gòu)象(conformation)：蛋白質(zhì)分子是由氨基酸首尾相連而成的共價(jià)多肽

15、鏈，每一種蛋白質(zhì)都有自己特有的構(gòu)象，而不是一條走向隨機(jī)的松散鏈，這樣才能保證其特有的性質(zhì)和功能。,a.鹽鍵、b.f.氫鍵、c.疏水作用 d.范得華力、e.二硫鍵、g.酯鍵,2.3.2.2 多肽鏈折疊的空間限制 肽平面(peptide plane) 肽鍵 形式上是單鍵，其中C-N鍵長(zhǎng)0.132nm，比相鄰的N-C單鍵(0.147nm)短，而較一般C=N雙鍵(0.128nm)長(zhǎng)，可見(jiàn)，肽鍵中-C-N-鍵的性質(zhì)介于單、雙鍵之間，具有部分雙鍵的性質(zhì)，因而不能旋轉(zhuǎn)，使肽鍵的四個(gè)原子和與之相連的兩個(gè)碳原子(C)都處在同一個(gè)剛性平面。,肽鏈中只有碳原子所形成的單鍵能夠旋轉(zhuǎn)，它的旋轉(zhuǎn)決定兩個(gè)肽鍵平面的位置關(guān)系

16、，于是肽鍵平面成為肽鏈盤(pán)曲折疊的基本單位。,肽鍵中的C-N既具有雙鍵性質(zhì)，就會(huì)有順?lè)床煌牧Ⅲw異構(gòu)，已證實(shí)處于反位。,肽鏈主鏈上只有C連接的兩個(gè)鍵(CN、CC)是單鍵，它們可以旋轉(zhuǎn)，繞(CN)鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)角，繞(CC )鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)角，這兩個(gè)旋轉(zhuǎn)角度稱(chēng)二面角(dihedral angle) ?？杀硎境鱿噜彽碾钠矫娴南鄬?duì)位置。 =180 ， =180,當(dāng)C的一對(duì)二面角=180、=180時(shí)，的兩個(gè)相鄰肽平面呈充分伸展的構(gòu)象。二者均為0的構(gòu)象實(shí)際上不存在。,2.3.2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類(lèi)型 為了使暴露在多水介質(zhì)中的疏水基團(tuán)降低到最小程度，同時(shí)保持多肽鏈與周?chē)肿又g形成的氫鍵相互作用的有利能

17、量狀態(tài)，多肽鏈自發(fā)折疊形成由氫鍵維系的有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。,-螺旋結(jié)構(gòu)（-helix） 1950年P(guān)auling和Corey對(duì)-角蛋白(-keratin)進(jìn)行X線衍射分析，從衍射圖中看到有0.50.55nm的重復(fù)單位，故推測(cè)蛋白質(zhì)分子中有重復(fù)性結(jié)構(gòu)，認(rèn)為這種重復(fù)性結(jié)構(gòu)為-螺旋。 天然蛋白質(zhì)絕大多數(shù)為右手螺旋。,-螺旋的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 多個(gè)肽鍵平面通過(guò)-碳原子旋轉(zhuǎn)，相互緊密盤(pán)曲成規(guī)則的周期性構(gòu)象，即右手螺旋或左手螺旋。 主鏈呈螺旋上升，每3.6個(gè)氨基酸殘基上升一圈，相當(dāng)于0.54nm，每個(gè)AA殘基沿軸上升0.15nm。螺旋直徑0.5nm,相鄰兩圈螺旋之間借肽鍵中的N上的H和它

18、后面第4個(gè)AA殘基的CO上的O原子形成許多鏈內(nèi)氫健，氫鍵的取向與中心軸平行。氫鍵是穩(wěn)定螺旋的主要鍵。,- 螺旋中氨基酸側(cè)鏈R分布在螺旋外側(cè)，其形狀、大小及電荷影響-螺旋的形成。 酸性或堿性氨基酸集中的區(qū)域，由于同電荷相斥，不利于-螺旋形成；較大的R(如苯丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸)集中的區(qū)域，也妨礙-螺旋形成；脯氨酸因其-碳原子位于五元環(huán)上，不易扭轉(zhuǎn)，加之它是亞氨基酸，不易形成氫鍵，故不易形成上述-螺旋；甘氨酸的R基為H，空間占位很小，也會(huì)影響該處螺旋的穩(wěn)定。, 折疊結(jié)構(gòu)（ pleated） Astbury等人曾對(duì)-角蛋白進(jìn)行X線衍射分析，發(fā)現(xiàn)具有0.7nm的重復(fù)單位。 如將毛發(fā)-角蛋白在濕熱條

19、件下拉伸，可拉長(zhǎng)到原長(zhǎng)二倍，這種-螺旋的X線衍射圖可改變?yōu)榕c-角蛋白類(lèi)似的衍射圖。說(shuō)明-角蛋白中的結(jié)構(gòu)和-螺旋拉長(zhǎng)伸展后結(jié)構(gòu)相同。,折疊也稱(chēng)-片層（pleated sheet） conformation)是由兩條或多條幾乎完全伸展的多肽鏈側(cè)向通過(guò)氫鍵連接在一起，相鄰兩肽鏈以相同或相反方向平行排列成片狀。, -片層結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 肽鏈處于相當(dāng)伸展的結(jié)構(gòu)，肽鏈平面之間折疊成鋸齒狀。每個(gè)AA殘基伸展的長(zhǎng)度為0.35，AA殘基的R側(cè)鏈伸出在鋸齒的上方或下方。 依靠?jī)蓷l肽鏈或一條肽鏈內(nèi)的兩段肽鏈間的C=O與另一條的-NH基之間形成氫鍵，使構(gòu)象穩(wěn)定。,兩段肽鏈可以是平行的或是反平行的。 平行的-片層結(jié)構(gòu)中，兩

20、個(gè)殘基的間距為0.65nm；反平行的-片層結(jié)構(gòu)，則間距為0.7nm。,反平行結(jié)構(gòu),平行結(jié)構(gòu), 轉(zhuǎn)角（ turn） 也稱(chēng)彎曲(bend)、回折(reverse turn)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin structure)，是指肽鏈出現(xiàn)的180回折，由彎曲處的第一個(gè)AA殘基的-C=O與第四個(gè)AA殘基的-NH之間形成氫鍵(41氫鍵)。產(chǎn)生一種不很穩(wěn)定的環(huán)形結(jié)構(gòu)。,無(wú)規(guī)卷曲 沒(méi)有確定規(guī)律性的部分肽鏈構(gòu)象，肽鏈中肽鍵平面不規(guī)則排列，屬于松散的無(wú)規(guī)卷曲(random coil)。,頭發(fā)的結(jié)構(gòu),燙發(fā)的生化過(guò)程,蛋白質(zhì)的一，二，三，四級(jí)結(jié)構(gòu),2.3.3 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure)

21、2.3.3.1 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域 超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域都是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次。 超二級(jí)結(jié)構(gòu)(super-secondary structure) 超二級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈內(nèi)順序上相互鄰近的若干二級(jí)結(jié)構(gòu)單元常在空間折疊中靠近，相互作用形成規(guī)則的結(jié)構(gòu)組合體(combination) ，充當(dāng)三級(jí)結(jié)構(gòu)的構(gòu)件。,己知的超二級(jí)結(jié)構(gòu)有3種基本組合形式：螺旋組合()；折疊組合()和螺旋折疊組合() ，其中組合最常見(jiàn)。它們可直接作為三級(jí)結(jié)構(gòu)的“建筑塊”或結(jié)構(gòu)域的組成單位，是蛋白質(zhì)構(gòu)象中二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的一個(gè)層次。, 由二股或三股右手-螺旋彼此纏繞而成的左手超螺旋(superhelix)

22、，存在于-角蛋白、肌球蛋白和纖維蛋白中。 由兩段或三段平行折疊鏈（單股鏈）和一段連結(jié)鏈組成，連結(jié)鏈為-螺旋或無(wú)規(guī)則卷曲。最常見(jiàn)的 組合是由三段平行式的折疊鏈和二段-螺旋鏈構(gòu)成，稱(chēng)為Rossmann折疊(Rossmann fold)。 是由幾段平行的折疊鏈連結(jié)而成，有曲折和回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)兩種類(lèi)型。,幾種超二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)域(domain) 在較大的球狀蛋白質(zhì)分子中，由于多肽鏈上相鄰的超二級(jí)結(jié)構(gòu)緊密聯(lián)系，形成幾個(gè)緊密球狀構(gòu)象，彼此以松散的肽鏈相連，此球狀構(gòu)象就是結(jié)構(gòu)域。 每個(gè)結(jié)構(gòu)域一般約由100-200個(gè)氨基酸殘基組成，各有獨(dú)特的空間構(gòu)象，并承擔(dān)不同的生物學(xué)功能。結(jié)構(gòu)域是多肽鏈的折疊單位，多肽鏈折疊的

23、最后一步是結(jié)構(gòu)域的締合，小分子蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域和三級(jí)結(jié)構(gòu)往往是同一個(gè)意思。,如免疫球蛋白(IgG)由12個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中兩個(gè)輕鏈上各有2個(gè)，兩個(gè)重鏈上各有4個(gè)；補(bǔ)體結(jié)合部位與抗原結(jié)合部位處于不同的結(jié)構(gòu)域。,2.3.3.2 蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是多肽鏈在各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)側(cè)鏈基團(tuán)的相互作用，借助次級(jí)鍵維系，進(jìn)一步盤(pán)繞折疊形成具有一定規(guī)律的三維空間結(jié)構(gòu)。,穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要是次級(jí)鍵，包括：氫鍵、疏水鍵、鹽鍵以及范德華力等。 這些次級(jí)鍵可存在于一級(jí)結(jié)構(gòu)序號(hào)相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基的R基團(tuán)之間，因此蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要指氨基酸殘基的側(cè)鏈間的結(jié)合。因此，三級(jí)結(jié)構(gòu)是由多肽鏈的AA順

24、序決定的。,次級(jí)鍵都是非共價(jià)鍵，易受環(huán)境中pH、溫度、離子強(qiáng)度等的影響，有變動(dòng)的可能性。二硫鍵不屬于次級(jí)鍵，但在某些肽鏈中能使遠(yuǎn)隔的二個(gè)肽段聯(lián)系在一起，這對(duì)于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定上起著重要作用。,蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子主鏈折疊盤(pán)曲形成構(gòu)象的基礎(chǔ)上，分子中的各個(gè)側(cè)鏈所形成一定的構(gòu)象。側(cè)鏈構(gòu)象主要是形成結(jié)構(gòu)域。球狀蛋白質(zhì)的很多親水側(cè)鏈形成親水區(qū)，主要分布在蛋白質(zhì)分子表面；由疏水側(cè)鏈集中構(gòu)成疏水區(qū)，多在分子內(nèi)部，疏水區(qū)常形成一些“洞穴”或“口袋”，某些輔基就鑲嵌其中，成為活性部位。,具備三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)有細(xì)長(zhǎng)型的纖維狀蛋白質(zhì)(fibrous protein)，如絲心蛋白；基本上呈球形的球狀蛋

25、白質(zhì)(globular protein)，如血漿清蛋白、球蛋白、肌紅蛋白。 球狀蛋白的疏水基多聚集在分子的內(nèi)部，而親水基則多分布在分子表面，因而球狀蛋白質(zhì)是親水的，更重要的是，多肽鏈經(jīng)過(guò)如此盤(pán)曲后，可形成某些發(fā)揮生物學(xué)功能的特定區(qū)域，例如酶的活性中心等。,肌紅蛋白和丙糖磷酸異構(gòu)酶的三級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程,2.3.4 蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternary structure ),具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的幾條多肽鏈通過(guò)次級(jí)鍵相互組合而形成的特定構(gòu)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。(寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式)。,亞基(subunit、單體)：四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中的每一個(gè)具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的多

26、肽鏈稱(chēng)為亞基(subunit)或亞單位、單體(monomer)。 四級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)際上是指亞基的立體排布、相互作用及接觸部位的布局。亞基之間不含共價(jià)鍵，亞基間次級(jí)鍵的結(jié)合比二、三級(jí)結(jié)構(gòu)疏松，因此在一定的條件下，四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)可分離為其組成的亞基，而亞基本身構(gòu)象仍可不變。 亞基單獨(dú)存在時(shí)無(wú)生物活性或活性很低，只有聚合成特定的四級(jí)結(jié)構(gòu)才具有完整的生物活性。,一種蛋白質(zhì)中亞基結(jié)構(gòu)可相同（均一），也可不同（不均一）。 如煙草斑紋病毒的外殼蛋白是由2200個(gè)相同的亞基形成的多聚體；正常人血紅蛋白A是2個(gè)亞基與2個(gè)亞基形成的四聚體。 單體蛋白質(zhì)（monomer protein）：無(wú)四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)稱(chēng)單體蛋白，

27、如：溶菌酶、肌紅蛋白等。 寡聚蛋白質(zhì)（multimeric protein）：由兩個(gè)或多個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)稱(chēng)寡聚蛋白（多體蛋白），如：血紅蛋白。,血紅蛋白蛋白,血紅蛋白,某些蛋白質(zhì)分子可進(jìn)一步聚合成聚合體(polymer)。聚合體中的重復(fù)單位稱(chēng)為單體(monomer)，聚合體可按其中所含單體的數(shù)量不同而分為二聚體、三聚體寡聚體(oligomer)和多聚體(polymer)而存在，如胰島素(insulin)在體內(nèi)可形成二聚體及六聚體。,煙草花葉病毒,球狀蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的形成：多肽鏈的主鏈?zhǔn)紫日郫B成一系列二級(jí)結(jié)構(gòu)，相鄰的構(gòu)象單元隨即組合成規(guī)則的超二級(jí)結(jié)構(gòu)，若干超二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)一步盤(pán)旋產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)或

28、多個(gè)結(jié)構(gòu)域形成具有獨(dú)立三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基，若干亞基組裝成具有特定四級(jí)結(jié)構(gòu)的寡聚體。,2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的順序異構(gòu)現(xiàn)象是蛋白質(zhì)生物功能多樣性和種屬特異性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，如一個(gè)由20種氨基酸組成的20肽，有21018種順序異構(gòu)體。 2.4.1 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)與生物功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，特定的空間構(gòu)象主要是由蛋白質(zhì)分子中肽鏈和側(cè)鏈R基團(tuán)形成的次級(jí)鍵來(lái)維持，蛋白質(zhì)的多肽鏈在體內(nèi)被合成后，即可根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)自然折疊和盤(pán)曲，形成一定的空間構(gòu)象。,因此，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了它的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，即由一級(jí)結(jié)構(gòu)可以自動(dòng)地發(fā)展到二、三級(jí)結(jié)構(gòu)。,一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)，其基本構(gòu)象

29、及功能也相似。 胰島素分子中氨基酸殘基的差異部分,2.4.1.1 一級(jí)結(jié)構(gòu)的種屬差異與分子進(jìn)化 同源蛋白質(zhì)(homologous protein)的種屬差異與生物進(jìn)化 同源蛋白質(zhì)是指在不同有機(jī)體中實(shí)現(xiàn)同一功能的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白)。 同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中有許多位置的氨基酸對(duì)所有的種屬是相同的，稱(chēng)不變殘基(invariant residue)；而其它位置的氨基酸對(duì)不同的種屬有相當(dāng)大的變化，稱(chēng)可變殘基(variable residue)；同源蛋白質(zhì)的氨基酸順序中這樣的相似性稱(chēng)為順序同源(sequence homology)。,不同種屬來(lái)源的細(xì)胞色素c (cytochrome c)中，可以變換的

30、氨基酸殘基數(shù)目與這些種屬在系統(tǒng)發(fā)生上的位置有密切關(guān)系，即在進(jìn)化位置上相距愈遠(yuǎn)，則氨基酸順序之間的差別愈大。,CytC分子中Aa殘基的差異數(shù)目及分歧時(shí)間,2.4.1.2 一級(jí)結(jié)構(gòu)的變異與分子病 在蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個(gè)分子中發(fā)生一個(gè)殘基的異常，該蛋白質(zhì)的功能也會(huì)受到明顯的影響。 被稱(chēng)之為“分子病”的鐮刀狀紅細(xì)胞性貧血僅僅是574個(gè)氨基酸殘基中，一個(gè)氨基酸殘基改變所造成的。,血紅蛋白亞基N端的第6號(hào)氨基酸殘基發(fā)生了變異，它變異來(lái)源于基因上遺傳信息的突變。,2.4.1.3 一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)激活 動(dòng)物體內(nèi)的某些生化反應(yīng)中，蛋白質(zhì)分子

31、的部分肽鏈必須先按特定的方式斷裂，然后才呈現(xiàn)生物活性。,血液凝固的生物化學(xué) 血液凝固是一系列復(fù)雜的生化過(guò)程，一是血漿中的凝血酶原受到血漿和血小板中一些因子的激活而形成凝血酶（thrombin）；二是血漿中的纖維蛋白原在凝血酶的激活下轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白（fibrin）網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使血液變成凝膠。,凝血系統(tǒng)有保護(hù)機(jī)體的作用，同時(shí)血液中還存在另一個(gè)防止凝血堵塞血管的系統(tǒng)，即纖維蛋白溶酶原，被激活后轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白溶酶(fibrinolysin或plasmin)，它的作用是使纖維蛋白溶解。上面這三個(gè)激活過(guò)程都是專(zhuān)一性很高的一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部水解作用。肽鏈的局部斷裂導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的出現(xiàn)。,胰島素原的激活

32、胰島素是在胰島的-細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體(ribosome)上合成的。 最初合成的是前胰島素原(preproinsulin)，它是胰島素原的前體，而胰島素原是胰島素的前體。,前胰島素原比胰島素原在N末端上多一段20個(gè)殘基左右肽鏈，稱(chēng)信號(hào)肽(signal peptide) 。信號(hào)肽的主要作用是引導(dǎo)新生的多肽進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。待肽鏈進(jìn)入腔后立即被信號(hào)肽酶(signal peptidase)切去“前”順序。形成的胰島素原被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w(Golgi apparatus)然后貯存在儲(chǔ)存顆粒(storage granule)內(nèi)，并在此在特異的肽酶作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚砸葝u素。,2.4.2 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系

33、核糖核酸酶S中的4個(gè)二硫鍵維持其三級(jí)結(jié)構(gòu)，用巰基乙醇的尿素溶液證明了蛋白質(zhì)的功能取決于特定的天然構(gòu)象，而規(guī)定其構(gòu)象所需的信息包含在它的氨基酸序列中。,Anfinsen研究124個(gè)Aa殘基的核糖核酸酶，其多肽鏈中有4對(duì)二硫鍵，用大量巰基乙醇和適量尿素還原4對(duì)二硫鍵，酶活力全部喪失，如將尿素和巰基乙醇除去，并在有氧條件下使-SH緩慢氧化成二硫鍵，此時(shí)酶的活力水平可接近于天然的酶。,核糖核酸酶的變性和復(fù)性過(guò)程,雖然血紅蛋白和肌紅蛋白的氨基酸殘基數(shù)和氨基酸序列都有相當(dāng)大的差異，但它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)幾乎完全相同，血紅蛋白的亞基和肌紅蛋白的單體分子各有一個(gè)血紅素，都能與O2結(jié)合。,血紅蛋白的亞基之間相互作用形

34、成穩(wěn)定的四級(jí)結(jié)構(gòu)，使其中的血紅素與O2的結(jié)合能力降低，而當(dāng)血紅蛋白分子中一個(gè)亞基的血紅素與O2結(jié)合后，立即引起該亞基的構(gòu)象發(fā)生變化，這種構(gòu)象變化隨即通過(guò)亞基間的次級(jí)鍵引起另外3個(gè)亞基的構(gòu)象改變，結(jié)果改變了整個(gè)分子的構(gòu)象，使所有亞基都變成適宜與O2結(jié)合的構(gòu)象，從而使血紅蛋白的氧合速度大大加快。這種現(xiàn)象稱(chēng)為別構(gòu)效應(yīng)。,別構(gòu)效應(yīng)（allosteric site）：蛋白質(zhì)與配基結(jié)合改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的生物活性的現(xiàn)象。 別構(gòu)蛋白質(zhì)（allosteric protein）：具別構(gòu)效應(yīng)的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)除活性部位外，還有與別的配基結(jié)合的部位。別構(gòu)蛋白都為寡聚蛋白。,以血紅蛋白(hemoglobi

35、n,簡(jiǎn)寫(xiě)Hb)為例來(lái)說(shuō)明構(gòu)象與功能的關(guān)系。 血紅蛋白是紅細(xì)胞中所含有的一種結(jié)合蛋白質(zhì)，它的蛋白質(zhì)部分稱(chēng)為珠蛋白(globin)，非蛋白質(zhì)部分(輔基)稱(chēng)為血紅素。,Hb分子由四個(gè)亞基構(gòu)成，每一亞基結(jié)合一分子血紅素。 人Hb分子的4個(gè)亞基有2條鏈和2條鏈。每一亞基都具有獨(dú)立的三級(jí)結(jié)構(gòu)，各肽鏈折疊盤(pán)曲形成球狀，表面為親水區(qū)，球形向內(nèi)有20多個(gè)巰水Aa側(cè)鏈構(gòu)成口袋形的疏水區(qū)，輔基血紅素就嵌接在其中，亞基和亞基構(gòu)象相似。,血紅蛋白亞基的構(gòu)象,四個(gè)亞基22聚合成具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的Hb分子。,血紅蛋白亞基間鹽鍵示意圖,Hb在體內(nèi)的主要功能為運(yùn)輸氧氣，而Hb的別構(gòu)效應(yīng)，極有利于它在肺部與O2結(jié)合及在周?chē)M織釋放O

36、2。 Hb是通過(guò)其輔基血紅素的Fe2+與氧發(fā)生可逆結(jié)合的，血紅素的鐵原子共有6個(gè)配位鍵，其中4個(gè)與血紅素的吡咯環(huán)的N結(jié)合，一個(gè)與珠蛋白亞基組氨酸殘基的咪唑基的N相連接，空著的一個(gè)配位鍵可與O2可逆地結(jié)合，結(jié)合物稱(chēng)氧合血紅蛋白。,血紅素的 結(jié)構(gòu)式,Fe在氧合時(shí)落入血紅素平面,在血紅素中，四個(gè)吡咯環(huán)形成一個(gè)平面，在未與氧結(jié)合時(shí)Fe2+的位置高于平面0.7，一旦O2進(jìn)入某一個(gè)亞基的疏水“口袋”時(shí)，與Fe2+的結(jié)合會(huì)使Fe2+嵌入四吡咯平面中，也即向該平面內(nèi)移動(dòng)約0.75。,鐵的位置的微小移動(dòng)，牽動(dòng)組氨酸殘基連同其所在肽段及附近肽段構(gòu)象改變，造成兩個(gè)亞基間鹽鍵斷裂而結(jié)合變松，并促進(jìn)第2亞基的變構(gòu)并氧合

37、，后者又促進(jìn)第3亞基的氧合使Hb分子中第4亞基的氧合速度為第1亞基開(kāi)始氧合時(shí)速度的數(shù)百倍。,這種一個(gè)亞基的別構(gòu)作用，促進(jìn)另一亞基變構(gòu)的現(xiàn)象，稱(chēng)為亞基間的協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)。所以在不同氧分壓下，Hb氧飽和曲線呈“S”型。,2.5 蛋白質(zhì)的重要性質(zhì) 蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的大分子化合物，其部分理化性質(zhì)與氨基酸相似，如兩性電離、等電點(diǎn)、呈色反應(yīng)、成鹽反應(yīng)等，同時(shí)又具有膠體性和變性等。,2.5.1 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量和測(cè)定方法 蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量一般在104106。其相對(duì)分子質(zhì)量可根據(jù)其化學(xué)組成測(cè)定或者利用蛋白質(zhì)的某些理化性質(zhì)來(lái)測(cè)定。,沉降速度法 將蛋白質(zhì)溶液放在超速離心機(jī)的離心

38、管中進(jìn)行超速離心。由于超過(guò)重力幾十萬(wàn)倍的離心力的作用，而使蛋白質(zhì)分子沉降下來(lái)。大小和形狀都相同的蛋白質(zhì)分子下沉速度相同，在離心管中產(chǎn)生一個(gè)明顯的界面，利用光學(xué)系統(tǒng)可以觀察到此界面的移動(dòng)，從而測(cè)得蛋白的沉降速度。 一種顆粒在單位離心力場(chǎng)中沉降速率為恒定值，稱(chēng)沉降系數(shù)(sedimentation coefficient，)，用s表示。,分析性超速離心系統(tǒng)圖示,已測(cè)得許多蛋白質(zhì)的s值都在110-1320010-13秒之間。因此，采用110-13秒作為沉降系數(shù)的一個(gè)單位，用S(Svedberg unit)表示。 例如：某蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)為3010-13秒，可用30S表示。用超速離心法測(cè)得某種蛋白質(zhì)的沉

39、降系數(shù)之后，則可按照一定的公式，計(jì)算出該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。,凝膠過(guò)濾法 在層析柱中裝入葡聚糖凝膠顆粒。這種凝膠顆粒具有多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這些網(wǎng)孔只允許較小的分子進(jìn)入顆粒內(nèi)，而大于網(wǎng)孔的分子則被排阻。當(dāng)用洗脫液洗脫時(shí)，被排阻的相對(duì)分子質(zhì)量大的分子先被洗脫下來(lái)，相對(duì)分子質(zhì)量小的分子后下來(lái)。,凝膠顆粒,將3種以上相對(duì)分子質(zhì)量有較大的差異的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)制成混合溶液，經(jīng)上柱和洗脫，根據(jù)洗脫峰的位置，量出各種蛋白質(zhì)的洗脫體積。 以相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg Mr)和洗脫體積作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測(cè)蛋白質(zhì)在相同條件下的洗脫體積，在標(biāo)準(zhǔn)曲線查出其相對(duì)分子質(zhì)量。 此法僅適用于球狀分子的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。,SDS聚丙烯

40、酰胺凝膠電泳法 蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度，決定于蛋白分子的大小、形狀和電荷數(shù)量；而在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度，則決定于蛋白質(zhì)分子的大小。 SDS(十二烷基硫酸鈉)是一種去垢劑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使其變性并帶上大量的負(fù)電荷，解離成亞基，同時(shí)變成棒狀，從而掩蓋了蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的差異。這樣，蛋白質(zhì)的電泳速度只決定于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小。,SDS-凝膠電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的相對(duì)遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成直線關(guān)系。 用幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)對(duì)相應(yīng)的相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)測(cè)得的樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上可以查出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量。,2.5.2 蛋

41、白質(zhì)的膠體性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子量很大，一般在10000 1000000之間，在水溶液中分子直徑在1100nm之間，具有膠體溶液的性質(zhì)，如不能通過(guò)半透膜、電泳現(xiàn)象等。因此可用透析和電泳的方法來(lái)分離、純化蛋白質(zhì)。,維特蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定性的因素 水化層：球狀蛋白質(zhì)表面多親水基團(tuán)(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等） ，具有強(qiáng)烈地吸引水分子作用，在水溶液中蛋白質(zhì)顆粒的表面形成一層很厚的水化膜，從而阻止蛋白質(zhì)顆粒的相互聚集。 同性電荷：在非等電點(diǎn)時(shí)蛋白顆粒帶有同性電荷，相互排斥。,2.5.3 蛋白質(zhì)的兩性電離及等電點(diǎn) 蛋白質(zhì)是由AA組成的高分子化合物，具有許多游離的氨基、羧基、咪唑基、胍基、巰基、酚

42、基等，因此與AA一樣，能象酸一樣解離，也能象堿一樣解離，也是兩性電解質(zhì)。,當(dāng)溶液在某一 pH 值時(shí)，蛋白質(zhì)所帶正、負(fù)電荷相等，即總凈電荷為零，此時(shí)溶液的 pH 稱(chēng)該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(isoelectric point)。,蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，因沒(méi)有同性電荷排斥，故最不穩(wěn)定，溶解度最小，極易借靜電引力結(jié)合成較在的聚集體沉淀出來(lái)（分離提純蛋白質(zhì)的方法）。 電泳：帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向電荷相反的電極泳動(dòng)的現(xiàn)象。電泳方法是實(shí)驗(yàn)室、生產(chǎn)、臨床診斷等常用來(lái)分離蛋白質(zhì)和鑒定蛋白質(zhì)純度的手段。,2.5.4 蛋白質(zhì)變性作用 天然蛋白質(zhì)因受物理及化學(xué)因素的影響，使其分子原有的天然構(gòu)象發(fā)生變化（次級(jí)鍵破壞），從而導(dǎo)致理化性

43、質(zhì)和生物活性發(fā)生改變，稱(chēng)為變性(denaturation)。 變性蛋白質(zhì)只有空間構(gòu)象的破壞，蛋白質(zhì)變性本質(zhì)是次級(jí)鍵，二硫鍵的破壞，并不涉及一級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。,引起蛋白質(zhì)發(fā)生變性的因素 化學(xué)因素：強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、尿素、胍、去污劑、重金屬鹽、十二烷基磺酸鈉(SDS)、苦味酸、濃乙醇等。 物理因素：加熱(70100)、加壓、脫水、劇烈振蕩或攪拌、紫外線、X-射線照射、超聲波、高壓處理等。 變性因素常被應(yīng)用于消毒及滅菌；保存蛋白質(zhì)制劑時(shí)應(yīng)注意防止蛋白質(zhì)變性。,變性蛋白質(zhì)的特點(diǎn)： 生物活性的喪失； 包藏在分子內(nèi)部的側(cè)鏈基團(tuán)暴露； 理化性質(zhì)改變：如變性后疏水基外露，溶解度降低形成沉淀。但在堿性溶液中或有變性劑存

44、在時(shí)不沉淀，除去變性劑后則沉淀。球狀蛋白質(zhì)在變性后，分子伸展不對(duì)稱(chēng)程度增加，粘度加大，擴(kuò)散系數(shù)降低； 生化性質(zhì)改變，蛋白質(zhì)變性后分子結(jié)構(gòu)伸展松散，因此，變性蛋白質(zhì)比天然蛋白質(zhì)更易受蛋白酶作用，這就是熟食易于消化的道理。,復(fù)性(renaturation)：當(dāng)變性因素去除后，有的變性蛋白質(zhì)又可緩慢重新回復(fù)到天然構(gòu)象，此現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)的復(fù)性。 例如，核糖核酸酶在-巰基乙醇和8M尿素作用下發(fā)生的變性，經(jīng)過(guò)透析去除尿素和-巰基乙醇，酶蛋白又可恢復(fù)其原來(lái)的構(gòu)象，生物學(xué)活性也幾乎全部恢復(fù)。 許多蛋白質(zhì)變性時(shí)被破壞嚴(yán)重，不能恢復(fù)，稱(chēng)為不可逆性變性。,2.5.5 蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng) 破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)

45、就會(huì)凝聚成大的質(zhì)點(diǎn)而從溶液中析出的現(xiàn)象稱(chēng)為蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)。 穩(wěn)定蛋白質(zhì)親水膠體的因素是顆粒表面的水化層和電荷。若除掉這兩個(gè)穩(wěn)定因素（如調(diào)節(jié)溶液pH至等電點(diǎn)和加入脫水劑），蛋白質(zhì)便容易凝集析出。高濃度中性鹽、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、生物堿試劑等都可引起蛋白質(zhì)沉淀。,中性鹽 加入高濃度的中性鹽（如H4N2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀。這種加鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱(chēng)為鹽析(salting out)。鹽析法是最常用的分離蛋白質(zhì)的方法。,鹽溶與鹽析： 鹽溶（salting in）：低濃度的中性鹽可增

46、加蛋白質(zhì)的溶解度。由于蛋白質(zhì)分子吸附某些鹽類(lèi)離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子相互排斥，而蛋白質(zhì)分子與水分子的相互作用加強(qiáng)，因此溶解度提高。,鹽析（salting out ）：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性而使其析出，這種方法稱(chēng)為鹽析。 由于大量中性鹽的加入，使水的活度降低，原來(lái)溶液中的大部分自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團(tuán)與水分子間的相互作用，破壞了蛋白質(zhì)分子表面的水化層，同時(shí)又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)沉淀。,常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等。各種蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需的鹽濃度及pH不同，故可用于對(duì)混和蛋白質(zhì)組分的分離。 用半飽和的硫酸銨來(lái)沉淀出血清中

47、的球蛋白，飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉淀出來(lái)。鹽析沉淀的蛋白質(zhì)，經(jīng)透析除鹽，仍保證蛋白質(zhì)的活性。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的pH至等電點(diǎn)后，再用鹽析法則蛋白質(zhì)沉淀的效果更好。,有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì) 可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對(duì)水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。 調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液至等電點(diǎn)時(shí)，加入有機(jī)溶劑可加速蛋白質(zhì)沉淀。 常溫下有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。在低溫條件下，則變性進(jìn)行較緩慢，可用于分離制備蛋白質(zhì)。,重金屬鹽沉淀蛋白質(zhì) 當(dāng)溶液pH值高于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結(jié)合成不溶

48、性鹽而沉淀。 重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的，誤食重金屬鹽后可大量飲用牛奶或豆?jié){等蛋白質(zhì)，然后用催吐劑將結(jié)合的重金屬鹽嘔吐出來(lái)解毒。 若在低溫條件下，并控制重金屬離子濃度，也可用于分離制備不變性的蛋白質(zhì)。,生物堿試劑和某些酸類(lèi)沉淀蛋白質(zhì) pH小于等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)帶正電荷，易與帶負(fù)電（酸根陰離子）的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過(guò)氯酸、硝酸) 生成不溶性鹽而沉淀。 血液化學(xué)分析時(shí)常利用此原理除去血液中的蛋白質(zhì)，此類(lèi)沉淀反應(yīng)也可用于檢驗(yàn)?zāi)蛑械鞍踪|(zhì)。,加熱凝固(coagulation) 將接近于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)溶液加熱，可使蛋白質(zhì)發(fā)生凝固而沉淀。 加熱使蛋白質(zhì)變性，有規(guī)則的肽鏈

49、結(jié)構(gòu)被打開(kāi)呈松散狀不規(guī)則的結(jié)構(gòu)，分子的不對(duì)稱(chēng)性增加，疏水基團(tuán)暴露，進(jìn)而凝聚成凝膠狀的蛋白塊。如煮熟的雞蛋，蛋黃和蛋清都凝固。,蛋白質(zhì)的變性、沉淀，凝固相互之間有很密切的關(guān)系。但蛋白質(zhì)變性后并不一定沉淀，變性蛋白質(zhì)只在等電點(diǎn)附近才沉淀，沉淀的變性蛋白質(zhì)也不一定凝固。例如，蛋白質(zhì)被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿變性后由于蛋白質(zhì)顆粒帶著大量電荷，故仍溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)減之中。但若將強(qiáng)堿和強(qiáng)酸溶液的pH調(diào)節(jié)到等電點(diǎn)，則變性蛋白質(zhì)凝集成絮狀沉淀物，若將此絮狀物加熱，則分子間相互盤(pán)纏而變成較為堅(jiān)固的凝塊。,2.5.6 蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng) 雙縮脲反應(yīng) 茚三酮反應(yīng) 米倫反應(yīng) 坂口反應(yīng) Folin-酚反應(yīng) 醋酸鉛反應(yīng) 蛋白質(zhì)的黃色反應(yīng),2

50、.6 蛋白質(zhì)的分離提純和應(yīng)用 每種細(xì)胞都含有成千上萬(wàn)種不同的蛋白質(zhì)。為了研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能，需將其分離、純化，盡量除去不需要的和變性的蛋白質(zhì)，提高單位質(zhì)量蛋白質(zhì)中所要的蛋白質(zhì)的含量或活性。必須根據(jù)所分離蛋白質(zhì)的性質(zhì)、含量、分離的目的選擇一套適當(dāng)?shù)某绦颉?2.6.1 蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 蛋白質(zhì)分離提純的一般程序分為前處理、粗分級(jí)和細(xì)分級(jí)3步。 前處理 以適當(dāng)方式將組織細(xì)胞破碎，使蛋白質(zhì)以溶解狀態(tài)釋放出來(lái)，并保持其天然構(gòu)象和原有生物活性。 動(dòng)植物組織一般可用組織搗碎機(jī)、勻漿器和超聲波破碎法；植物組織用研磨或用纖維素酶處理；微生物細(xì)胞用超聲波法、高壓擠壓或溶菌酶處理。,組織破碎需加入適當(dāng)緩沖液并在低溫下進(jìn)行，必要時(shí)加入蛋白酶抑制劑、巰基試劑等。對(duì)膜蛋白需加入去垢劑使膜結(jié)構(gòu)瓦解