生物化學(xué)與分子生物學(xué)八年制課件8.ppt

1、第七章 酶與催化反應(yīng)ENZYMES AND CATALYTIC REACTIONS,酶學(xué)研究簡史,公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。 1833年，Anselme Payen提純了麥芽淀粉糖化酶（淀粉酶）。 1878年，Wilhelm Khne首次提出enzyme一詞。 1894年，Emil Fischer證明了酶的專一性，酶與底物之間作用的鎖鑰關(guān)系。 1897年，Buchner兄弟用不含細(xì)胞的酵母提取液，實現(xiàn)了發(fā)酵。 1913年，Leonor Michaelis和Maud Menten推導(dǎo)出酶反應(yīng)的動力學(xué)方程式。 19261930年，James Sumner和John H. Northrop分

2、別將脲酶和胃蛋白酶、胰蛋白酶制成結(jié)晶，確定了酶的蛋白質(zhì)本質(zhì)。 1941年，George Beadle和Edward Tatum的“一個基因一個酶”假說首次將蛋白質(zhì)與基因聯(lián)系在一起，推動了生物化學(xué)與遺傳學(xué)的結(jié)合。 1982年，Cech首次發(fā)現(xiàn)RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W. Szostak研究室首先報道了具有DNA連接酶活性DNA片段，稱為脫氧核酶(deoxyribozyme)。,第一節(jié) 酶和酶促反應(yīng) Enzymes and Enzymatic Reactions,一、化學(xué)反應(yīng)具有熱力學(xué)和動力學(xué)特性,（一）熱力學(xué)性質(zhì)涉及反應(yīng)平衡和能量平衡

3、,1反應(yīng)平衡可用平衡常數(shù)來描述,一定的溫度下，Keq與反應(yīng)的初始濃度無關(guān)，它反映化學(xué)反應(yīng)的本性。 Keq越大則反應(yīng)越傾向于產(chǎn)物的生成，即正向反應(yīng)進(jìn)行得越完全；Keq越小則逆反應(yīng)的程度越大。 Keq是化學(xué)反應(yīng)可能進(jìn)行的最大限度的量度。,2自由能的變化是化學(xué)反應(yīng)的動力,反應(yīng)物的自由能（G）與其焓、溫度（T）和熵（S）相關(guān)，等于其焓減去絕對溫度和熵的乘積，即G = H TS 。,在生物系統(tǒng)中，生物分子在等溫、等壓條件下，在化學(xué)反應(yīng)中能量的變化可以用自由能變（ G）來量度。, G = H TS,自由能的變化是化學(xué)反應(yīng)的動力，影響化學(xué)反應(yīng)的方向。,反應(yīng)方向與H、S和T的關(guān)系,3標(biāo)準(zhǔn)自由能變與平衡常數(shù)有關(guān)

4、,標(biāo)準(zhǔn)自由能變（G）是指在標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下的自由能變,（二）動力學(xué)性質(zhì)是對反應(yīng)速率的描述,動力學(xué)是研究化學(xué)反應(yīng)速率及其影響因素的科學(xué)。,反應(yīng)速率是單位體積內(nèi)反應(yīng)進(jìn)度隨時間的變化率,任何反應(yīng)速率均由底物濃度和速率常數(shù)（rate constant, k）所決定。,一級反應(yīng)（first-order reaction）:單底物反應(yīng) 二級反應(yīng)（second-order reaction） ：雙底物反應(yīng),二、酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),（一）單純酶僅含有氨基酸組分,有些酶其分子結(jié)構(gòu)僅由氨基酸殘基組成，沒有輔助因子。這類酶稱為單純酶（simple enzyme）。 如脲酶、一些蛋白酶、淀粉酶、酯酶和核糖核酸酶等。,（二

5、）結(jié)合酶既含有氨基酸組分又含有非氨基酸組分,結(jié)合酶（conjugated enzyme）是除了在其組成中含有由氨基酸組成的蛋白質(zhì)部分外，還含有非蛋白質(zhì)部分,輔助因子分類 （按其與酶蛋白結(jié)合的緊密程度）,一些化學(xué)穩(wěn)定的小分子有機(jī)化合物是重要的輔酶或輔基。,輔酶在反應(yīng)過程中可與多種酶蛋白結(jié)合，作為底物在不同的酶之間傳遞電子、質(zhì)子或化學(xué)基團(tuán)。,輔基在反應(yīng)中不能離開與其結(jié)合的酶蛋白。,小分子有機(jī)化合物輔酶（輔基）的種類與作用,金屬離子的作用： 作為酶活性中心的組成部分參加催化反應(yīng)，使底物與酶活性中心的必需基團(tuán)形成正確的空間排列，有利于酶促反應(yīng)的發(fā)生； 作為連接酶與底物的橋梁，形成三元復(fù)合物； 金屬離子

6、還可以中和電荷，減小靜電斥力，有利于底物與酶的結(jié)合； 金屬離子與酶的結(jié)合還可以穩(wěn)定酶的空間構(gòu)象，穩(wěn)定酶的活性中心。,金屬酶(metalloenzyme) 金屬離子與酶結(jié)合緊密，提取過程中不易丟失。 金屬激活酶(metal-activated enzyme) 金屬離子為酶的活性所必需，卻不與酶直接結(jié)合，而是通過底物相連接。,金屬酶和金屬激活酶,（三）單體酶僅含有一條肽鏈而寡聚酶含有兩條或兩條以上的肽鏈,三、按酶所催化反應(yīng)的類型將酶分為六大類,（一）催化氧化還原反應(yīng)的酶屬于氧化還原酶類,氧化還原酶類（oxidoreductases）包括催化傳遞電子和氫、以及需氧參加反應(yīng)的酶。例如，脫氫酶類、加氧酶

7、類、過氧化物酶和過氧化氫酶等。,（二）催化分子間基團(tuán)轉(zhuǎn)移或交換的酶屬于轉(zhuǎn)移酶類,轉(zhuǎn)移酶類（transferases）包括將磷酸基從ATP轉(zhuǎn)到另外底物的激酶、加無機(jī)磷酸使化學(xué)鍵斷裂的磷酸化酶，以及糖基轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)氨酶等。,（三）催化底物發(fā)生水解反應(yīng)的酶屬于水解酶類,水解酶類（hydrolases）,按其所水解的底物不同,根據(jù)它們的作用部位,蛋白酶、酯酶、 磷酸酶、糖苷酶、 核酸酶,外切酶、內(nèi)切酶,（四）催化從底物移去一個基團(tuán)并形成雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)的酶屬于裂合酶類,（五）催化同分異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化的酶類屬于異構(gòu)酶類,異構(gòu)酶類（isomerases）：催化分子內(nèi)部基團(tuán)的位置互變、幾何或光學(xué)異構(gòu)體互變、

8、以及醛酮互變的酶類。,如：變位酶、表構(gòu)酶、異構(gòu)酶。,（六）催化兩種底物形成一種產(chǎn)物同時偶聯(lián)有高能鍵的水解釋能的酶屬于合成酶類,DNA連接酶、氨基酰-rRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶屬于連接酶或合成酶類。,合成酶類（synthetases）又稱連接酶類（ligases）。,四、酶可按其所催化的反應(yīng)類型予以命名,（一）酶的系統(tǒng)命名法可反映出酶的多種信息但比較繁瑣,系統(tǒng)命名法根據(jù)酶所催化的整體反應(yīng)，按酶的分類對酶命名，每個酶都有一個名稱和一個編號 。,編號中4個數(shù)字中第1個數(shù)字是酶的分類號，第2個數(shù)字代表在此類中的亞類，第3個數(shù)字表示亞-亞類，第4個數(shù)字表示該酶在亞-亞類中的序號。,酶的分類與命名舉例

9、,（二）推薦名稱簡便而常用,由于系統(tǒng)名稱較煩瑣，國際酶學(xué)委員會還同時為每一個酶從常用的習(xí)慣名稱中挑選出一個推薦名稱（recommended name）,系統(tǒng)名稱 L-乳酸：NAD+氧化還原酶 推薦名稱 乳酸脫氫酶,五、同工酶催化相同的化學(xué)反應(yīng),（一）同工酶是催化相同化學(xué)反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的一組酶,定義:同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化學(xué)反應(yīng)，而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)乃至免疫學(xué)性質(zhì)不同的一組酶。,同工酶主要由于基因倍增（duplication）和趨異（divergence）所致。,* 舉例：乳酸脫氫酶(LDH1 LDH5),（二）同工酶在生物體中的表達(dá)分布具有時空特異性,同工酶存在于

10、同一種屬的不同個體，同一個體的不同組織、同一細(xì)胞的不同亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以及同一組織、細(xì)胞的不同發(fā)育階段。,人體各組織器官LDH同工酶譜（活性%）,（三）檢測組織器官同工酶譜的變化有重要的臨床意義,在代謝調(diào)節(jié)上起著重要的作用； 用于解釋發(fā)育過程中階段特有的代謝特征； 同工酶譜的改變有助于對疾病的診斷； 同工酶可以作為遺傳標(biāo)志，用于遺傳分析研究。,第二節(jié) 酶的工作原理 Mechanism of Enzymatic Reactions,、酶具有與一般催化劑相似的工作原理,（一）酶與一般催化劑一樣能降低反應(yīng)的活化能,1活化能是化學(xué)反應(yīng)的能障,活化能：指在一定溫度下一摩爾底物（substrate）從低自由能

11、的初始態(tài)轉(zhuǎn)變成能量較高的過渡態(tài)所需要的自由能，即過渡態(tài)中間產(chǎn)物比基態(tài)底物高出的那部分能量。,酶和一般催化劑加速反應(yīng)的機(jī)制都是降低反應(yīng)的活化能(activation energy)。酶比一般催化劑更有效地降低反應(yīng)的活化能。,2活化能的降低可使反應(yīng)速率呈指數(shù)上升,（二）酶與一般催化劑一樣能加速化學(xué)反應(yīng)而不改變反應(yīng)的平衡點,酶與一般催化劑一樣，只能加快反應(yīng)速率，使其縮短到達(dá)反應(yīng)平衡的時間，而不能改變反應(yīng)的平衡點。,反應(yīng)達(dá)到平衡時自由能的變化僅取決于底物與產(chǎn)物的自由能之差。,任何催化劑都不能改變底物和產(chǎn)物自身的自由能。,二、酶具有不同于一般催化劑的顯著特點,酶的催化效率通常比無催化劑時的自發(fā)反應(yīng)高10

12、81020倍，比一般無機(jī)催化劑高1071013倍。,（一）酶對底物具有極高的催化效率,酶的特異性或?qū)Ｒ恍裕╯pecificity）,酶對其所催化的底物和反應(yīng)類型具有嚴(yán)格的選擇性，一種酶只作用于一種化合物，或一類化學(xué)鍵，催化一定的化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生一定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物的現(xiàn)象。,（二）酶對底物具有高度的特異性或?qū)Ｒ恍?1.有的酶對其底物具有極其嚴(yán)格的絕對專一性,有的酶僅對一種特定結(jié)構(gòu)的底物起催化作用，產(chǎn)生具有特定結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。酶對底物的這種極其嚴(yán)格的選擇性稱為絕對特異性（absolute specificity）。,脲酶僅水解尿素，對甲基尿素則無反應(yīng)。,2.多數(shù)酶對其底物具有相對特異性,多數(shù)酶可對一類化合物或

13、一種化學(xué)鍵起催化作用，這種對底物分子不太嚴(yán)格的選擇性稱為相對特異性（relative specificity）。,脂肪酶不僅水解脂肪，也可水解簡單的酯。,胰蛋白酶水解由堿性氨基酸（精氨酸和賴氨酸）的羧基所形成的肽鍵。,各種蛋白酶對肽鍵的專一性,人體內(nèi)有多種蛋白激酶，它們均催化底物蛋白質(zhì) 絲氨酸（或蘇氨酸）殘基上羥基的磷酸化,3. 有些酶對其底物表現(xiàn)出立體異構(gòu)專一性,酶對空間構(gòu)型所具有的特異性要求稱為空間異構(gòu)特異性（stereospecificity）,延胡索酸酶僅對延胡索酸(反丁烯二酸)起催化作用，將其加水生成蘋果酸，對順丁烯二酸則無作用,乳酸脫氫酶僅催化L-乳酸脫氫生成丙酮酸，而對D-乳酸無

14、作用。,三、酶活性中心是酶與底物結(jié)合并將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的特定部位,（一）酶分子上的必需基團(tuán)與酶的活性密切相關(guān),溶菌酶的活性中心,酶的活性中心由許多必需基團(tuán)組成,必需基團(tuán)(essential group) 酶分子中氨基酸殘基側(cè)鏈的化學(xué)基團(tuán)中，與酶活性密切相關(guān)的化學(xué)基團(tuán)。,活性中心內(nèi)的必需基團(tuán),位于活性中心以外，維持酶活性中心應(yīng)有的空間構(gòu)象所必需。,活性中心外的必需基團(tuán),底 物,活性中心以外的必需基團(tuán),結(jié)合基團(tuán),催化基團(tuán),活性中心,目 錄,組成酶活性中心的必需基團(tuán)在一級結(jié)構(gòu)上可能相距很遠(yuǎn)，但在形成三級結(jié)構(gòu)時相互接近，形成具有三維結(jié)構(gòu)的區(qū)域，且多是酶分子中的裂隙或凹陷所形成的疏水口袋。,（二）酶的活

15、性中心的構(gòu)象有利于酶與底物結(jié)合及催化反應(yīng),胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性中心“口袋”,（一）酶與底物之間的相互作用表現(xiàn)有多種效應(yīng),1酶與底物結(jié)合時相互誘導(dǎo)發(fā)生構(gòu)象改變,誘導(dǎo)契合假說（induced-fit hypothesis）,酶-底物復(fù)合物,酶與底物相互接近時，其結(jié)構(gòu)相互誘導(dǎo)、相互變形和相互適應(yīng)，進(jìn)而相互結(jié)合。這一過程稱為酶-底物結(jié)合的誘導(dǎo)契合假說 。,四、酶對底物具有多種催化機(jī)制,羧肽酶的誘導(dǎo)契合模式,2形成酶-底物過渡態(tài)復(fù)合物過程中釋放結(jié)合能,底物與酶的活性中心相互誘導(dǎo)契合形成過渡態(tài)化合物，過渡態(tài)與酶的活性中心以次級鍵(氫鍵、離子鍵、疏水鍵)相結(jié)合，這一過程是釋能反應(yīng)，所釋放的

16、能量稱為結(jié)合能(binding energy)。 結(jié)合能可以抵消一部分活化能，是酶反應(yīng)降低活化能的主要能量來源。 酶不能使底物形成過渡態(tài)，則沒有結(jié)合能的釋放，也就不能催化反應(yīng)的進(jìn)行。,3鄰近效應(yīng)和定向排列有利于底物形成過渡態(tài),鄰近效應(yīng)（proximity effect）和定向排列（orientation arrange）將分子間的反應(yīng)變成類似分子內(nèi)的反應(yīng)，使反應(yīng)速率顯著提高。,在疏水環(huán)境中進(jìn)行酶反應(yīng)有很大的優(yōu)越性，此現(xiàn)象稱為表面效應(yīng)（surface effect）。,酶的活性中心多位于其分子內(nèi)部的疏水“口袋”中，酶反應(yīng)在酶分子內(nèi)部的疏水環(huán)境中進(jìn)行。疏水環(huán)境可使底物分子脫溶劑化（desolvat

17、ion），排除周圍大量水分子對酶和底物分子中功能基團(tuán)的干擾性吸引或排斥，防止二者之間形成水化膜，利于底物和酶分子之間的直接密切接觸和相互結(jié)合。,4. 表面效應(yīng)有利于底物和酶的接觸與結(jié)合,（二）酶對底物呈現(xiàn)多元催化,酶是兩性解離的蛋白質(zhì)，酶活性中心上有些基團(tuán)是質(zhì)子供體（酸），有些是質(zhì)子接受體（堿）。,這些基團(tuán)在酶活性中心的準(zhǔn)確定位有利于質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，這種一般酸-堿催化（general acid-base catalysis）可以使反應(yīng)速率提高102105倍。,質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)都包含一般酶-堿催化反應(yīng),酶分子中具有酸-堿催化作用的基團(tuán),酶可與底物形成瞬時共價鍵,很多酶在催化過程中，與底物形成瞬時共價鍵，

18、底物與酶形成共價鍵后被激活，并很容易進(jìn)一步水解形成產(chǎn)物和游離的酶。這種催化機(jī)制稱為共價催化（covalent catalysis）。,AB + E： AE + B H2O AE A + E：+ B,酶的親核基團(tuán)與底物共價結(jié)合,酶可通過親核催化或親電子催化加速反應(yīng),酶活性中心有的催化基團(tuán)屬于親核基團(tuán)，可以提供電子給帶有部分正電荷的過渡態(tài)底物，形成瞬間共價鍵。這種催化作用稱為親核催化（nucleophilic catalysis）。,親電子催化（electrophilic catalysis）可使酶活性中心的陽離子親電子基團(tuán)與富含電子的底物形成共價鍵。,胰凝乳蛋白酶的親核催化、共價催化和酸-堿催化

19、機(jī)制,第三節(jié) 酶促反應(yīng)動力學(xué) The Kinetics of Enzymatic Reactions,概念 研究各種因素對酶促反應(yīng)速率的影響，并加以定量的闡述。 影響因素包括有 酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。, 研究一種因素的影響時，其余各因素均恒定。,單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)； 酶促反應(yīng)速率（velocity，V）一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示； 反應(yīng)速率取其初速率，即底物的消耗量很小（一般在5以內(nèi)）時的反應(yīng)速率； 底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度。,研究前提,一、采用酶促反應(yīng)初速率來研究酶促反應(yīng)動力學(xué),（一）酶活性是指酶催化化學(xué)反應(yīng)的能力,衡量酶活性

20、的尺度是酶促反應(yīng)速率的大小。 酶促反應(yīng)速率可用單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量來表示。 由于底物的消耗量不易測定，所以實際工作中經(jīng)常是測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量。,酶的活性: 以國際單位（international unit, IU）表示。 在規(guī)定的實驗條件下（如溫度、pH的限定和足夠的底物濃度等），每分鐘催化1mol底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為1個國際單位（IU）。,催量（Katal）,1IU16.67109 Kat,1催量是指在特定條件下，每秒鐘將1mol底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物所需的酶量,（二）酶促反應(yīng)初速率是反應(yīng)剛剛開始時測得的反應(yīng)速率,酶促反應(yīng)初速率是指反應(yīng)剛剛開始，各種影響因素尚未發(fā)揮作

21、用時的酶促反應(yīng)速率，即反應(yīng)時間進(jìn)程曲線為直線部分時的反應(yīng)速率。,（三）有三類方法可用來測定底物或產(chǎn)物的變化量,1直接測定法是對底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行直接檢測,有些酶促反應(yīng)可在反應(yīng)進(jìn)行一定時間后，不用任何輔助反應(yīng)便可直接測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物的濃度。這類測定方法稱為直接測定法（direct assay）。,還原型（Fe2+）細(xì)胞色素c在波長550nm處有明顯的吸收峰，而氧化型（Fe3+）則無；細(xì)胞色素C氧化酶對細(xì)胞色素C的氧化反應(yīng)，可以直接在波長550nm處檢測一定時間內(nèi)還原型細(xì)胞色素C的減少過程 。,有些酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物不能直接進(jìn)行檢測，必須增加一些輔助試劑來達(dá)到檢測的目的，這種方法稱為間

22、接測定法（indirect assay）,2間接測定法利用非酶輔助反應(yīng)對底物或產(chǎn)物量的變化進(jìn)行間接檢測,3酶偶聯(lián)測定法是間接反映初始反應(yīng)的底物或產(chǎn)物量的變化量,許多酶促反應(yīng)的底物和產(chǎn)物雖然不能直接檢測，但可以與另外的酶反應(yīng)相偶聯(lián)，偶聯(lián)的酶以第一個酶的產(chǎn)物為底物，或以此類推，以最后的酶反應(yīng)產(chǎn)物可以直接檢測為目的。這種通過偶聯(lián)其他酶并對此酶促產(chǎn)物進(jìn)行直接檢測，間接地反映待測酶反應(yīng)的底物或產(chǎn)物變化量的方法稱為酶偶聯(lián)測定法（enzyme coupled assay）,外加的酶稱為工具酶或輔助酶（auxiliary enzyme）,產(chǎn)物可直接檢測的酶稱為指示酶（indicator enzyme）,丙氨酸

23、轉(zhuǎn)氨酶 丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脫氫酶 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+ （在340nm處有吸收峰） （在340nm處無吸收峰）,二、酶促反應(yīng)速率受底物濃度的影響,（一）酶促反應(yīng)速率對底物濃度作圖呈矩形雙曲線,在酶濃度和其他反應(yīng)條件不變的情況下，反應(yīng)速率V對底物濃度S作圖呈矩形雙曲線。,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時,反應(yīng)速率與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。,目 錄,隨著底物濃度的增高,反應(yīng)速率不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。,目 錄,當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度,酶被底物所飽和，反應(yīng)速率不再增加，達(dá)最大速率；反應(yīng)為零級反應(yīng)。,目 錄,（二）反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系

24、可用米-曼氏方程式表示,1米-曼氏方程定量地描述底物濃度與反應(yīng)速率的關(guān)系,1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速率與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米-曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelis equation)。,S：底物濃度 V：不同S時的反應(yīng)速率 Vmax：最大反應(yīng)速率(maximum velocity) m：米氏常數(shù)(Michaelis constant),米-曼氏方程式推導(dǎo)基于兩個假設(shè)： E與S形成ES復(fù)合物的反應(yīng)是快速平衡反應(yīng)，而ES分解為E及P的反應(yīng)為慢反應(yīng)，反應(yīng)速率取決于慢反應(yīng)。即 Vk3ES (1) S的總濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于E的總濃度，因此在反應(yīng)的初始階段，S的濃度

25、可認(rèn)為不變即SSt。,2米-曼氏方程的推導(dǎo)過程引入了穩(wěn)態(tài)概念,穩(wěn)態(tài)：是指ES的生成速率與分解速率相等，即 ES恒定。 k1 (EtES) Sk2 ES + k3 ES,則(2)變?yōu)? (EtES) S Km ES,當(dāng)?shù)孜餄舛群芨?，將酶的活性中心全部飽和時，即EtES，反應(yīng)達(dá)最大速率 Vmaxk3ESk3Et (5),將(5)代入(4)得米氏方程式：,KmS,Km值等于酶促反應(yīng)速率為最大反應(yīng)速率一半時的底物濃度，單位是mol/L。,（三）動力學(xué)參數(shù)可用來比較酶促反應(yīng)的動力學(xué)性質(zhì),1Km值等于即刻反應(yīng)速率達(dá)到Vmax一半時的底物濃度,2Km是酶的特征性常數(shù),在酶的結(jié)構(gòu)、溶液pH、溫度等條件不變的情

26、 況下，酶促反應(yīng)底物的Km不因反應(yīng)中酶濃度的改 變而不同。,同一酶對其所催化的不同底物有不同的Km； 不同酶對同一底物也有其各自的Km 。,Km的范圍多在10-610-2mol/L之間。,一些酶的底物的Km,3Km在一定條件下可表示酶對底物的親和力,當(dāng)k3 k2時，Km k2/k1。即相當(dāng)于ES分解為E + S 的解離常數(shù)（dissociation constant, Ks）。此時，Km代表酶對底物的親和力。,Km越大，表示酶對底物的親和力越?。?Km越小，表示酶對底物的親和力越大。,4Vmax是酶被底物完全飽和時的反應(yīng)速率,當(dāng)所有的酶均與底物形成ES時（即ES = Et），反應(yīng)速率達(dá)到最大。

27、 即Vmax = k3 Et。,5kcat代表酶的轉(zhuǎn)換數(shù),kcat = Vmax /Et,kcat表示酶被底物完全飽和時，單位時間內(nèi)每個酶分子（或活性中心）催化底物轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的分子數(shù)。,一些酶的轉(zhuǎn)換數(shù),6在低底物濃度時，kcat/Km代表酶的催化效率,kcat/Km是此二級反應(yīng)的速率常數(shù)，也稱特異性常數(shù)，其單位是L/(mol S) 。,反應(yīng)速率的大小取決于E和S由于相互滲透而相互碰撞的速率。.這種被滲透控制的碰撞速率(diffusion-controlled rate of encounter，DCRE)的上限是108 L/(mol S) 。kcat/Km越接近此數(shù)據(jù)，酶的催化效率越高。,一些

28、kcat/Km值接近DCRE的酶,（四）采用作圖法可求得酶促反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù),1林-貝氏作圖法是求得 Vmax和Km的最常用方法,林-貝氏方程式（Lineweaver-Burk equation）,將米氏方程式兩邊取倒數(shù)，并加以整理，則得出米氏方程式的雙倒數(shù)形式 ：,直線在縱軸的截距等于1/Vmax，而在橫軸上的截距為1/Km,2其他一些作圖法也可較準(zhǔn)確地求得Vmax和Km,直線的斜率等于1/Vmax，橫軸截距為-Km,伊迪-霍夫斯蒂作圖法（Eadie-Hofstee plot）,米氏方程式兩邊均除以S,直線的斜率為-Km，直線的縱軸截距為Vmax,三、在一定條件下酶促反應(yīng)速率與酶濃度呈正相關(guān)

29、,當(dāng)SE，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速率與酶濃度成正比 關(guān)系式為：V = k3 E,A：底物濃度曲線，其中，E1 E2 E3。從圖中可知， E的變化不影響酶促反應(yīng)的Km。,B：反應(yīng)速率對酶濃度作圖，V與E呈直線關(guān)系。,四、酶促反應(yīng)速率受反應(yīng)系統(tǒng)溫度的雙重影響,雙重影響 溫度升高，酶促反應(yīng)速率升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速率降低 。,最適溫度 (optimum temperature) 酶促反應(yīng)速率最快時的環(huán)境溫度。,哺乳動物組織中酶的最適溫度多在3540之間,Taq DNA聚合酶最適溫度為72,* 低溫的應(yīng)用,一般的酶在低溫下活性降低，但酶本身不被破壞，其活

30、性可隨溫度的回升而恢復(fù),低溫保存酶和菌種等生物制品,低溫麻醉,五、酶促反應(yīng)速率受反應(yīng)體系pH的影響,最適pH (optimum pH) 酶催化活性最大時的環(huán)境pH。,體內(nèi)酶的最適pH多在6.58之間。,胃蛋白酶的最適pH為1.8,精氨酸酶的最適pH為9.8,pH對幾種酶活性的影響,六、激活劑可加速酶促反應(yīng)速率,必需激活劑（essential activator） 為酶促反應(yīng)所必需，如缺乏則測不到酶的活性,Mg2+為己糖激酶的必需激活劑,非必需激活劑（non-essential activator） 可以提高酶的催化活性，但不是必需的,Cl-對唾液淀粉酶的激活作用,在酶促反應(yīng)中，凡能與酶結(jié)合而使

31、酶的催化活性下降或消失，但又不引起酶變性的物質(zhì)稱為酶的抑制劑（inhibitor，I）。,七、抑制劑對酶活性可表現(xiàn)出可逆或不可逆性抑制作用,抑制劑可與酶活性中心內(nèi)或活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，從而抑制酶的活性。,根據(jù)抑制劑與酶是否共價結(jié)合及抑制效果的不同，將抑制劑對酶的抑制作用分為可逆性抑制劑（reversible inhibitor）和不可性逆抑制劑（irreversible inhibitor）。,可逆性抑制劑,一類抑制劑與酶的調(diào)節(jié)部位結(jié)合，使酶發(fā)生變構(gòu)，從而對酶發(fā)揮抑制作用（別構(gòu)抑制作用）。,一類抑制劑通過與游離酶或/和酶-底物復(fù)合物可逆地結(jié)合而影響酶的催化活性。,可逆性抑制作用的抑制劑可

32、以與游離酶結(jié)合，形成二元復(fù)合物EI；也可以與ES結(jié)合，形成三元復(fù)合物ESI。,（一）可逆性抑制劑與酶非共價結(jié)合,1競爭性抑制劑與底物競爭酶的活性中心,定義： 抑制劑與底物的結(jié)構(gòu)相似或部分相似，能與底物競爭酶的活性中心，從而阻礙酶-底物復(fù)合物的形成，使酶的活性降低。這種抑制作用稱為競爭性抑制作用。,競爭性抑制作用V對S的雙倒數(shù)作圖,* 特點,抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力及底物濃度；,I與S結(jié)構(gòu)類似，或部分相似，競爭酶的活性中心；,動力學(xué)特點：Vmax不變，表觀Km增大。,* 舉例,丙二酸與琥珀酸競爭琥珀酸脫氫酶,磺胺類藥物的抑菌機(jī)制 與對氨基苯甲酸競爭二氫葉酸合成酶,2非競爭性抑制劑不影

33、響酶對底物的親和力,* 反應(yīng)模式,非競爭性抑制劑與酶活性中心外的某個部位結(jié)合，表現(xiàn)為非競爭性抑制作用（non-competitive inhibition）。,非競爭性抑制的米氏方程式的雙倒數(shù)形式,* 特點,抑制劑與酶活性中心外的必需基團(tuán)結(jié)合，底物與抑制劑之間無競爭關(guān)系；,抑制程度取決于抑制劑的濃度；,動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km不變。,3反競爭性抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合,* 反應(yīng)模式,反競爭性抑制作用的米氏方程式的雙倒數(shù)形式,* 特點：,抑制劑只與酶-底物復(fù)合物結(jié)合；,抑制程度取決于抑制劑的濃度及底物的濃度；,動力學(xué)特點：Vmax降低，表觀Km降低。,各種可逆性抑制作用的比較,（二

34、）不可逆性抑制劑與酶共價結(jié)合,不可逆性抑制作用的抑制劑,基團(tuán)特異性抑制劑（group-specific inhibitor） 底物類似物（substrate analog） 自殺性抑制劑（suicide inhibitor）,1基團(tuán)特異性抑制劑與酶分子中特異的基團(tuán)共價結(jié)合,半胱氨酸殘基上的巰基是許多酶的必需基團(tuán)。低濃度的重金屬離子(Hg2+、Ag2+、Pb2+等)及As3+等可與巰基酶分子中的巰基結(jié)合，使酶失活。,2底物類似物可共價地修飾酶的活性中心,與基團(tuán)特異性抑制劑不同，底物類似物與底物的結(jié)構(gòu)相似，可特異地與酶的活性中心共價結(jié)合，不可逆地抑制酶的活性。此類抑制劑可作為親和標(biāo)記物，用來定性酶

35、活性中心的功能基團(tuán)。,TPCK對胰凝乳蛋白酶活性中心組氨酸咪唑環(huán)的親和標(biāo)記,酶的自殺性抑制劑可以作為酶的底物與酶活性 中心相結(jié)合，生成酶-底物復(fù)合物，并接受酶的催化 作用。然而，經(jīng)催化后的中間產(chǎn)物不游離出產(chǎn)物， 而是轉(zhuǎn)化為酶的抑制劑，進(jìn)一步與酶活性中心共價 結(jié)合，對酶產(chǎn)生抑制作用。,3自殺性抑制劑是經(jīng)過修飾的酶的底物,+,酶-底物復(fù)合物 無活性酶中 被修飾的FAD,N，N-二甲基丙炔酰胺,自殺性抑制劑N,N-二甲基丙炔酰胺在被單胺氧化酶氧化后，由于填加1個質(zhì)子，使之與酶的輔基FAD結(jié)合生成穩(wěn)定的烷化物，從而酶被抑制。,單胺氧化酶通過其輔基FAD氧化N,N-二甲基丙炔酰胺(N,N-dimethy

36、lpropargyl amine)：,第四節(jié) 酶活性的調(diào)節(jié) Regulation of Enzyme Activities,機(jī)體通過改變調(diào)節(jié)酶的活性或誘導(dǎo)、阻遏酶的生物合成，可實現(xiàn)細(xì)胞代謝水平的調(diào)節(jié)；物質(zhì)代謝的整體調(diào)節(jié)和激素水平的調(diào)節(jié)最終也都是通過影響酶促反應(yīng)速率實現(xiàn)的。,一、調(diào)節(jié)酶的活性可受別構(gòu)效應(yīng)劑的調(diào)節(jié),（一）別構(gòu)效應(yīng)劑與別構(gòu)酶結(jié)合引發(fā)酶的構(gòu)象改變,別構(gòu)調(diào)節(jié) (allosteric regulation),一些代謝物可與某些酶分子活性中心外的某部分可逆地結(jié)合，使酶構(gòu)象改變，從而改變酶的催化活性，此種調(diào)節(jié)方式稱別構(gòu)調(diào)節(jié)。,別構(gòu)酶（allosteric enzyme）：能發(fā)生別構(gòu)效應(yīng)的酶,別

37、構(gòu)效應(yīng)劑（allosteric effector）： 能引起酶發(fā)生構(gòu)象改變的化合物,調(diào)節(jié)部位（regulatory site）： 別構(gòu)效應(yīng)劑與酶結(jié)合的部位,別構(gòu)酶也有兩種構(gòu)象形式，緊縮態(tài)(tense state, T state)和松弛態(tài)(relaxed state, R state)。T態(tài)和R態(tài)對底物的親和力或催化活性不同，別構(gòu)效應(yīng)劑就是通過引起酶R態(tài)與T態(tài)的互變，改變酶的催化速率。,（二）別構(gòu)效應(yīng)劑可引起別構(gòu)酶分子中各亞基間的協(xié)同作用,亞基的構(gòu)象改變可以相互影響，發(fā)生協(xié)同效應(yīng)。（cooperativity）,同種協(xié)同效應(yīng)（homotropic cooperativity）,別構(gòu)效應(yīng)劑引起的

38、構(gòu)象改變增加或降低后續(xù)亞基對同種別構(gòu)效應(yīng)劑的親和力。,別構(gòu)效應(yīng)劑引起的構(gòu)象改變增加酶對底物的親和力，這種現(xiàn)象（屬于異種正協(xié)同效應(yīng)）稱為別構(gòu)激活作用（allosteric activation）。此別構(gòu)效應(yīng)劑稱為別構(gòu)激活劑（allosteric activator）,（三）別構(gòu)酶的動力學(xué)不遵守米-曼氏方程,正協(xié)同效應(yīng)的底物濃度-反應(yīng)速率曲線為S形曲線,負(fù)協(xié)同效應(yīng)的底物-速率曲線外形類似矩形雙曲線，但不是矩形雙曲線,二、一些調(diào)節(jié)酶可在催化方向相反的兩種酶的作用下發(fā)生共價修飾,（一）磷酸化與去磷酸化是最常見的共價修飾方式,共價修飾(covalent modification)或 化學(xué)修飾(chemi

39、cal modification),酶分子中的某些基團(tuán)可在其他酶的催化下，共價結(jié)合某些化學(xué)基團(tuán)；同時又可在另一種酶的催化下，將此結(jié)合上的化學(xué)基團(tuán)去掉，從而影響酶的活性。,酶的共價修飾種類：,1. 磷酸化（phosphorylation） 和去磷酸化（dephosphorylation）,2. 甲基化（methylation） 和去甲基化（demethylation）,3. 腺苷化（adenylation） 和去腺苷化（deadenylation）,4. 尿苷化(uridylation) 和去尿苷化（deuridylation）,磷酸化和去磷酸化修飾是最常見的共價修飾,酶的磷酸化與脫磷酸化,（二

40、）共價修飾可引起級聯(lián)放大效應(yīng),在一個連鎖反應(yīng)中，一個酶被磷酸化或去磷酸化激活后，后續(xù)的其他酶可同樣的依次被其上游的酶共價修飾而激活，引起原始信號的放大，這種多重共價修飾的連鎖反應(yīng)稱為級聯(lián)反應(yīng)（cascade reaction）。,級聯(lián)反應(yīng)的主要作用是產(chǎn)生快速、高效的放大效應(yīng)。,三、酶原需經(jīng)激活后才具有催化活性,酶原 (zymogen) 有些酶在細(xì)胞內(nèi)合成或初分泌時只是酶的無活性前體，此前體物質(zhì)稱為酶原。,酶原的激活 在一定條件下，酶原向有活性酶轉(zhuǎn)化的過程。,酶原激活的原理,胰蛋白酶原的激活過程,消化蛋白酶原的激活,酶原激活的生理意義,避免細(xì)胞產(chǎn)生的酶對細(xì)胞進(jìn)行自身消化，并使酶在特定的部位和環(huán)境

41、中發(fā)揮作用，保證體內(nèi)代謝正常進(jìn)行。 有的酶原可以視為酶的儲存形式。在需要時，酶原適時地轉(zhuǎn)變成有活性的酶，發(fā)揮其催化作用。,第五節(jié) 酶與醫(yī)學(xué) Enzymes and Medical Sciences,一、酶與疾病的發(fā)生、診斷及治療密切相關(guān),（一）許多疾病與酶的質(zhì)和量的異常相關(guān),（二）體液中酶的活性可作為疾病的診斷指標(biāo),2. 惡性腫瘤可因腫瘤組織的增殖加快，其標(biāo)志酶釋放入血增多，有助于對該組織腫瘤的診斷。,前列腺癌病人血清酸性磷酸酶含量增高。,組織器官損傷可使其組織特異性的酶釋放入血，有助于對此組織器官疾病的診斷。,急性肝炎時，血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活性升高。,3. 有些酶的清除和排泄障礙也可造成血清含量升高。,肝硬化時血清堿性磷酸酶活性升高。,4. 酶的誘導(dǎo)合成增多也可以從血清中檢測出來，用于協(xié)助診斷和預(yù)后判斷。,膽管阻塞時膽汁返流可刺激肝合成堿性磷酸酶增多。,（三）酶作為藥物可用于疾病的治療,胰蛋白酶、溶菌酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等可加強(qiáng)傷口的凈化、抗炎和防止?jié){膜粘連等。在某些外敷藥中加入透明質(zhì)酸酶可以增強(qiáng)藥物的擴(kuò)散作用。,2.有些酶用于清潔傷口和抗炎,（四）有些藥物通過抑制或激活體內(nèi)某種酶的活性起治療作用,一些藥物通過抑制某些酶的活性，糾正體內(nèi)代謝紊亂。如抗抑郁藥通過抑制單胺氧化酶而減少兒茶酚胺的滅活，治療抑郁癥。洛伐他汀通過競爭性抑制HMG-CoA還