植物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn).ppt

1、提高植物細(xì)胞培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的方法,初生代謝(primary metabolism)是指能使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)換成細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)、維持細(xì)胞正常的生命活動(dòng)或能量的代謝，初生代謝的產(chǎn)物稱為初生代謝產(chǎn)物(primary metabolites)，如糖、蛋白質(zhì)、脂類、核酸等。它們是維持細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的。 次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites)是指植物體內(nèi)的一大類細(xì)胞生命活動(dòng)或植物生長(zhǎng)發(fā)育正常運(yùn)行非必需的小分子有機(jī)化合物，其產(chǎn)生和分布通常具有種屬、器官、組織和生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性，次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝(secondary metabolism) 。,前言,細(xì)胞培

2、養(yǎng)核心理論依據(jù)： 植物細(xì)胞的“全能性” ，即植物體任何一個(gè)細(xì)胞都攜帶著一套發(fā)育成完整植株的全部遺傳信息，在離體培養(yǎng)情況下，這些信息可以表達(dá)，在一定條件下具有發(fā)育成一個(gè)完整植株的能力。,從細(xì)胞培養(yǎng)中得到的食物添加劑,從植物細(xì)胞培養(yǎng)獲得藥品,植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)流程,Pathway events involved in biosynthesis of a metabolite in plant cells: primary metabolism and secondary metabolism (pre-biosynthetic, biosynthetic, and post-biosyntheti

3、c pathways).,1.外植體選擇 2.高產(chǎn)細(xì)胞系選擇 3.物理因素：光照、pH、通氣、接種量 4.化學(xué)因素：培養(yǎng)基種類及激素 誘導(dǎo)劑 前提物質(zhì)添加 抑制劑添加 5.培養(yǎng)方法：兩步培養(yǎng)技術(shù)、兩相培養(yǎng)、固定化 6.產(chǎn)物誘導(dǎo)釋放,提高次生代謝物的產(chǎn)量的方法,1. 外植體選擇,首先必須選擇能夠高效合成目的產(chǎn)物的植物種類。 起始培養(yǎng)材料還應(yīng)考慮器官和組織特異性，通常選取自然狀態(tài)下能夠積累次生產(chǎn)物部位的細(xì)胞，這樣的細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)以后常常具有合成目的產(chǎn)物的能力，或比較容易誘導(dǎo)合成目的產(chǎn)物。 東北紅豆杉幼嫩莖、葉片以及芽三種外植體的愈傷組織中紫杉醇含量比較顯示，以葉片為外植體的愈傷組織，其紫杉醇含量是其

4、它兩種外植體形成的愈傷組織的3倍。 在茜草（Rubia cordifolia）愈傷組織培養(yǎng)中，來(lái)源于葉柄和莖的愈傷組織蒽醌的積累量比來(lái)源于莖尖和葉的愈傷組織高。,解決植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝物含量低的最有效的手段之一是篩選高產(chǎn)細(xì)胞株。用來(lái)篩選的細(xì)胞來(lái)源可以是有足夠生理和形態(tài)異質(zhì)性的細(xì)胞群，也可以是通過(guò)物理或化學(xué)因子誘變處理產(chǎn)生的突變體群。 篩選方法:目測(cè)法,放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、流動(dòng)細(xì)胞測(cè)定法、瓊脂小塊法等。,2. 高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選,轉(zhuǎn)基因技術(shù) 目前, 使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)和瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng), 生產(chǎn)出帶有目的基因的高產(chǎn)細(xì)胞系, 然后進(jìn)行大量篩選, 可 獲得能生產(chǎn)特定次生代謝產(chǎn)物的目的細(xì)

5、胞系.,優(yōu)勢(shì): 投資小, 成本低; 使用安全, 植物細(xì)胞的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單, 易于成活; 便于進(jìn)行遺傳操作; 經(jīng)轉(zhuǎn)化后的目的細(xì)胞系易于儲(chǔ)藏, 方便生產(chǎn)。 主要方法: 土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法; 重組病毒感染植株; 基因槍轉(zhuǎn)化法; 花粉管通道轉(zhuǎn)化法。,反義技術(shù),反義技術(shù)：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù), 將人工合成的反義RNA 導(dǎo)入到植物基因組內(nèi), 與要抑制的代謝途徑的關(guān)鍵酶基因RNA 結(jié)合形成雙鏈RNA 來(lái)阻斷基因的正常表達(dá), 進(jìn)而促進(jìn)目的基因的表達(dá)。,原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體融合：指通過(guò)人為的方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，借以獲得兼有雙親遺傳性狀的穩(wěn)定重組子的過(guò)程。 意義：打破了微生物的種

6、界界限，可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣菌株的基因重組?？墒惯z傳物質(zhì)傳遞更為完整、獲得更多基因重組的機(jī)會(huì)?？膳c其他育種方法相結(jié)合，如把常規(guī)誘變和原生質(zhì)體誘變所獲得 的優(yōu)良性狀，組合到一個(gè)單株中。,發(fā)根培養(yǎng),發(fā)根(hairy root)：是整體植物或其某一器官、組織(包括愈傷組織)、單個(gè)細(xì)胞甚至原生質(zhì)體受發(fā)根農(nóng)桿菌感染所產(chǎn)生的一種病理現(xiàn)象，它起源于單個(gè)細(xì)胞，形成多分支、生長(zhǎng)迅速的不定根。 優(yōu)勢(shì)：具有生長(zhǎng)迅速且無(wú)需添加外源激素、擁有親本植株的特征次生代謝途徑和遺傳穩(wěn)定性、處于分化狀態(tài)等特點(diǎn)，尤其是它的生長(zhǎng)迅速和穩(wěn)定性的特點(diǎn)是工業(yè)化生產(chǎn)夢(mèng)寐以求的，也是細(xì)胞培養(yǎng)和一般器官培養(yǎng)所不能兼?zhèn)涞摹?煙草發(fā)根,長(zhǎng)春花發(fā)根,冠癭組織是

7、植物受到根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染而誘導(dǎo)產(chǎn)生的，也具有激素自養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)。用冠癭組織培養(yǎng)不僅能生產(chǎn)原植物根中合成的有效成分，而且還能產(chǎn)生原植物地上 部分特別是葉中合成的成分，因此冠癭組織作為一種新型的培養(yǎng)系統(tǒng)將具有更廣闊的應(yīng)用前景。,冠癭組織培養(yǎng),光照：對(duì)次生代謝產(chǎn)物的合成有重要影響. 不同植物細(xì)胞生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物時(shí), 對(duì)光質(zhì)和光量的要求是不同的, 如玫瑰茄懸浮細(xì)胞合成花青素時(shí), 藍(lán)光是促進(jìn)玫瑰茄細(xì)胞產(chǎn)生花青素的最有效單色光, 產(chǎn)量為416 mg/ L, 和全色光差不多, 紅光和橙光無(wú)效, 其他單色光隨其波長(zhǎng)接近藍(lán)光, 正效應(yīng)增強(qiáng)。 pH值：植物

8、細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜pH 值在5-6 之間,但也存在差異。研究表明,南方紅豆杉( Tax us chinensis ) 的愈傷組織生長(zhǎng)及紫杉醇的含量受pH 值的影響較大,pH 5.5 對(duì)愈傷組織生最為有利,達(dá)接種量的3.84 倍,但紫杉醇的含量較 低,pH 7.0 時(shí),愈傷組織的生長(zhǎng)量?jī)H為接種量2.80倍,而紫杉醇含量卻達(dá)pH 5.5 時(shí)的2 倍多。,3. 物理因素,溫度：不同種類的植物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)溫度的要求是不同的, 最適的溫度為25 左右, 超過(guò)30 , 對(duì)生長(zhǎng)有明顯的抑制作用. 較低的溫度有利于生物堿的合成, 而高溫則會(huì)導(dǎo)致次生代謝產(chǎn)物的合成基本停止。 通氣狀況：國(guó)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn): 利用生物反

9、應(yīng)器培養(yǎng)長(zhǎng)春花細(xì)胞生產(chǎn)阿瑪堿時(shí), 溶解氧在29%-43% 時(shí),溶解氧與阿瑪堿的產(chǎn)量顯著相關(guān)。 接種量：接種量影響次生代謝產(chǎn)物的有效積累, 接種時(shí)必須滿足一定的接種量。,4. 化學(xué)因素,4.1 培養(yǎng)基成分 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分：一方面要滿足植物細(xì)胞的生物量 增長(zhǎng)，另一方面要使細(xì)胞能合成和積累次生產(chǎn)物。 一般來(lái)說(shuō)，增加培養(yǎng)基的N、P和K的濃度能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，而適當(dāng)增加糖濃度則有利于次生產(chǎn)物的合成。 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類、濃度對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和次生 產(chǎn)物的合成起著重要的作用。 紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，培養(yǎng)基中添加一定濃度的2,4-D，可以顯著提高細(xì)胞生長(zhǎng)速率，增加細(xì)胞生物量，添加適當(dāng)濃度的BA和KT，則可提高紫

10、杉醇的積累。,4.2 添加誘導(dǎo)子,誘導(dǎo)子，是指能夠誘導(dǎo)植物細(xì)胞中一個(gè)反應(yīng)，并形成細(xì)胞特征性自身防御反應(yīng)的分子。 目前使用的激發(fā)子可分為兩類： 非生物誘導(dǎo)子（abiotic elicitor） 輻射、金屬離子等。 生物誘導(dǎo)子（biotic elicitor） 生物激發(fā)子根據(jù)其來(lái)源不同又可分為外源性誘導(dǎo)子（exogenous elicitor）和內(nèi)源性誘導(dǎo)子（endogenous elicitor）。外源性激發(fā)子多來(lái)源于微生物，包括經(jīng)處理的有機(jī)體如菌絲，或微生物機(jī)體浸提物以及由微生物產(chǎn)生的多糖類、蛋白質(zhì)類以及脂肪酸類等。內(nèi)源激發(fā)子是來(lái)源于植物結(jié)構(gòu)的化合物。如降解細(xì)胞壁的酶類、細(xì)胞壁碎片、寡聚糖以及

11、其它有機(jī)分子。,誘導(dǎo)子能增強(qiáng)細(xì)胞的呼吸作用, 提供產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的 能量, 使細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 利于代謝物的形成、運(yùn)輸和積累。 目前應(yīng)用最廣、研究最多的是真菌誘導(dǎo)子, 如張長(zhǎng)平等在紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中加入真菌誘導(dǎo)子, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 紫杉醇的合成被加強(qiáng), 產(chǎn)量得到了顯著提高。 除真菌誘導(dǎo)子外, 目前在提高植物次生代謝產(chǎn)物方面研究得較多的還包括寡糖素、茉莉酸類、金屬離子和紫外光等.金屬離子作為誘導(dǎo)子主要有Cu2+ 、Ca2+ 、Mg2+等。 孫彬賢等以南方紅豆杉懸浮細(xì)胞為材料, 在懸浮細(xì)胞中加入茉莉酸甲酯, 紫杉醇含量提高了10倍。,4.3 前體飼喂,前體指處于目標(biāo)代謝物代謝途徑中上游的物質(zhì)

12、。上游化合物作為酶的底物，其濃度高低決定了催化反應(yīng)速度的大小，濃度高則反應(yīng)速度大。加入前體可以消除關(guān)鍵酶的阻礙或阻斷內(nèi)源性中間體的分隔和有效貯存，利于次生代謝物的生產(chǎn)。 向銀杏培養(yǎng)基中添加異戊二烯等前體物質(zhì), 有效地提高了銀杏內(nèi)酯B 的產(chǎn)量. 向東北紅豆杉懸浮細(xì)胞體系中加入前體物苯丙氨酸和醋酸鈉，可顯著提高紫杉醇含量且在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi), 隨前體物濃度的增加促進(jìn)作用加強(qiáng). 添加的前體物種類、濃度和時(shí)間對(duì)次生代謝產(chǎn)物的影響在很多細(xì)胞培養(yǎng)中也得到體現(xiàn)。,4.4 抑制劑的使用,植物次生代謝是多途徑的, 是植物體內(nèi)一系列酶促反應(yīng)的結(jié)果, 在離體培養(yǎng)條件下有初生物質(zhì)向次生物質(zhì)的轉(zhuǎn)化, 也有次生物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)

13、化. 抑制劑可抑制支路代謝和其它相關(guān)次級(jí)代謝途徑，使代謝過(guò)程有利于目的次生代謝物的產(chǎn)生。,5.1 兩步培養(yǎng) 兩步培養(yǎng)：生長(zhǎng)與生產(chǎn)非耦聯(lián)型的培養(yǎng)體系，細(xì)胞的最適生長(zhǎng)條件和最適生產(chǎn)條件是不同的。兩段培養(yǎng)法就是根據(jù)這點(diǎn)，把培養(yǎng)過(guò)程分為細(xì)胞生長(zhǎng)期和次生代謝物生產(chǎn)期兩個(gè)階段。在不同階段分別采取不同的培養(yǎng)條件，在細(xì)胞生長(zhǎng)期使接種細(xì)胞大量繁殖，提高比生長(zhǎng)速率，盡快獲得高密度細(xì)胞；在生產(chǎn)期則可保持細(xì)胞的高密度，維持存活率，降低細(xì)胞死亡速率，持續(xù)獲得目標(biāo)產(chǎn)物。 優(yōu)勢(shì)：較好地解決了細(xì)胞生物量增長(zhǎng)與次生代謝產(chǎn)物積累之間的矛盾,能同時(shí)滿足細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成的需要，大大提高了目的產(chǎn)物的產(chǎn)率。 以長(zhǎng)春花細(xì)胞培養(yǎng)中激素為例

14、，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中使用生長(zhǎng)素類物質(zhì)2,4-D可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)，在生產(chǎn)培養(yǎng)基中使用BA有利于產(chǎn)物生物堿的合成。,5 培養(yǎng)方法,技術(shù)產(chǎn)生背景：植物細(xì)胞次生產(chǎn)物在培養(yǎng)系統(tǒng)中的積累，有時(shí)對(duì)產(chǎn)物合成具有反饋抑制，有的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中后還會(huì)出現(xiàn)降解。要解決這些問(wèn)題，最適宜的方法是邊合成邊回收，由此而產(chǎn)生的兩相培養(yǎng)技術(shù)是較為理想的技術(shù)。 兩相培養(yǎng)技術(shù)：是在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細(xì)胞在水相中生長(zhǎng)，合成的次級(jí)代謝物質(zhì)分泌出來(lái)后轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中。 優(yōu)勢(shì)：不僅減少了產(chǎn)物的反饋抑制作用，從而可以提高產(chǎn)物產(chǎn)量，而且可以通過(guò)有機(jī)相的不斷回收及循環(huán)使用,實(shí)

15、現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。兩相培養(yǎng)技術(shù)能促進(jìn)原來(lái)存儲(chǔ)于細(xì)胞內(nèi)部的產(chǎn)物分泌。,5.2 兩相培養(yǎng),兩相培養(yǎng)技術(shù)主要由培養(yǎng)相和提取相組成，其技術(shù)關(guān)鍵是選擇合適的提取相。一般來(lái)說(shuō)，提取相的選擇目標(biāo)是具有較大的分離能力，同時(shí)對(duì)細(xì)胞細(xì)胞沒(méi)有毒副作用，不影響產(chǎn)物的化學(xué)穩(wěn)定性。 根據(jù)分離相的性質(zhì)，兩相培養(yǎng)可分為液液系統(tǒng)和液固系統(tǒng)。 液液培養(yǎng)系統(tǒng)中，分離相和培養(yǎng)基的化學(xué)性質(zhì)和比重不同，在系統(tǒng)中形成明顯區(qū)分的兩相，其分離相主要使用液體石蠟、烷類化合物、甘油等。 液固系統(tǒng)是指提取相以固態(tài)形式存在于系統(tǒng)中，主要通過(guò)吸附分離目的產(chǎn)物，目前使用的主要有活性炭、硅酸鎂載體、沸石、蠶絲以及樹脂等。,Kim 等在搖瓶及鼓泡塔反應(yīng)器中研究

16、紫草毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)紫草素的兩相培養(yǎng), 以十六烷為吸附劑, 當(dāng)加入量為30 mL/ L 時(shí), 明顯促進(jìn)了紫草素的合成, 產(chǎn)量最高。,5.3 固定化細(xì)胞培養(yǎng),技術(shù)背景：植物細(xì)胞個(gè)體較大、細(xì)胞壁僵硬且具有大的液泡，以上特性使其對(duì)剪切力十分敏感，易受機(jī)械損傷。 固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)：是在可控條件下使植物懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞聚集成團(tuán)并且限制在特定空間和表面上，使這些細(xì)胞團(tuán)在不損失生物量的同時(shí)能連續(xù)不斷的分泌次生代謝物質(zhì)。 優(yōu)勢(shì)：由于細(xì)胞位置固定，改善了生長(zhǎng)微環(huán)境，培養(yǎng)過(guò)程中形成的物理及化學(xué)梯度利于細(xì)胞的分化及組織化，利于次生代謝物質(zhì)的積累；細(xì)胞可反復(fù)利用，不需連續(xù)補(bǔ)加，利于非耦聯(lián)生長(zhǎng)的植物細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物的合成

17、； 改善傳質(zhì)；生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段可有效分開；減小培養(yǎng)體系中的剪切力；降低生產(chǎn)成本。,固定化的方法：主要有吸附在珠狀、網(wǎng)狀或泡沫表面的載體上，包埋在海藻酸鈉、殼聚糖、瓊脂糖等做成的多孔凝膠珠中，固定在平板或中空纖維膜上以及包埋在微膠囊中。 目前這一技術(shù)應(yīng)用中遇到的難題是次生代謝產(chǎn)物釋放的問(wèn)題，因?yàn)榇蟛糠执紊x產(chǎn)物都儲(chǔ)存在液泡內(nèi)，對(duì)其自身的積累起著負(fù)反饋?zhàn)饔?，使固定化培養(yǎng)不能連續(xù)操作?，F(xiàn)在，人工誘導(dǎo)植物細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的釋放又成為一個(gè)新的研究領(lǐng)域，但這些人工誘導(dǎo)手段往往使細(xì)胞喪失活性。另外，長(zhǎng)時(shí)間的固定化培養(yǎng)也易使細(xì)胞受污染的機(jī)會(huì)大大增加。,固定化細(xì)胞培養(yǎng),海藻酸鹽包埋法裝置,原理：海藻酸鹽在Ca

18、2+等多價(jià)陽(yáng)離子的存在下，糖中的羧基和陽(yáng)離子之間形成離子鍵，從而形成膠體溶液。如果采用磷酸、檸檬酸、EDTA等離子復(fù)合劑處理，又能使膠體溶解釋放出細(xì)胞。 操作：將水溶性的海藻酸鈉配成水溶液，并把酶或細(xì)胞分散在其中，然后將其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶液），使海藻酸鈉中的Na+，部分被Ca2+所取代而形成由多價(jià)離子交聯(lián)的離子網(wǎng)絡(luò)凝膠。,海藻酸鹽包埋法,6. 產(chǎn)物誘導(dǎo)釋放,培養(yǎng)細(xì)胞中有些產(chǎn)物可以分泌到培養(yǎng)基中, 但大部分產(chǎn)物一般都貯存于細(xì)胞液泡內(nèi)。無(wú)疑增加產(chǎn)物外滲就有可能提高細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物積累。 第一是增加細(xì)胞膜的通透性, 在培養(yǎng)基中加入各種誘導(dǎo)外滲物質(zhì)如DMSO、活性碳、非離子吸附樹脂或用超聲波等處理都可有效地刺激產(chǎn)物外滲進(jìn)而提高產(chǎn)物 產(chǎn)量。 第二是在培養(yǎng)基中加入吸收劑, 利用礦物油和miglyol 等形成的兩相系統(tǒng)處理母菊屬植物的培養(yǎng)細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)其滲到油相的精油含量比在單相系統(tǒng)中高70 倍。,有機(jī)溶劑處理：常用的有二甲亞砜及吐溫-20等。 二甲亞砜是一種高度甲基化物質(zhì), 可用于改變細(xì)胞壁/ 膜的滲透性, 如二甲亞砜滲透處理能促進(jìn)三七懸浮培養(yǎng)細(xì)胞, 使該細(xì)胞有效釋放胞內(nèi)皂甙. 劉