2015第七章 病毒變異(1)

1、第七章 病毒變異,重點: 1.病毒變異的幾種現(xiàn)象？ 2.導致干擾現(xiàn)象的原因 3.病毒突變的類型、定義及區(qū)別 難點: 1.DI顆粒的特征; 2. 錯義突變 、表型混合; 3.分子內重組與重配,一.論述,遺傳與變異是生物界不斷發(fā)生的普遍現(xiàn)象，也是物種形成和生物進化的基礎，微生物遺傳學作為一門獨立的學科，誕生于40年代，病毒遺傳學作為微生物遺傳學的重要組成部分，對于生物遺傳和變異的研究起到了重要促進作用，也為分子遺傳學的發(fā)展奠定了基礎，病毒的許多生物學特性，包括結構簡單，無性增殖方式，可經(jīng)C培養(yǎng),增殖迅速，便于純化等，使其具有作為遺傳學研究材料的獨特優(yōu)勢。,大多數(shù)病毒具有明顯的遺傳穩(wěn)定性，但由于病毒

2、不具有細胞的結構，其遺傳變異易受周圍環(huán)境的影響。特別是病毒以基因形式在細胞內繁殖，在繁殖過程中，病毒的核酸更易受細胞內環(huán)境的影響而發(fā)生改變，這就決定了病毒的遺傳具有較大的變異性。,二變異現(xiàn)象,首先講一下幾種變異現(xiàn)象 ： 1.毒力變異：“毒力”表示毒株或毒型間病原性的差異（如NDV按毒力分為強毒型，中毒型，弱毒型），具體表現(xiàn)為所能感染動物，組織和C范圍及其引起的癥狀、死亡率和病變的程度不同。 例如由感染動物，媒介昆蟲或污染物等分離的病毒株，毒力常常不同（因而可從不同養(yǎng)殖場分離不同毒株做自家疫苗，例IBD分離）。某些自然分離株的毒力很弱，經(jīng)過選育，?？捎米饕呙缍局?。,2. 抗原變異： 病毒抗原性差

3、別的表現(xiàn)。通常所謂的病毒“型”，實質上是病毒抗原性差別的表現(xiàn)，它們主要是用補體結合反應，沉淀反應，凝集反應以及中和試驗等血清學方法鑒別出來的，那些具有許多“型”的病毒，大都也是易于變異的病毒，流感V和口蹄疫V是其中最顯著的例子。,AIV：許多型;由16個血凝素H和9個N氨酸酶組合而成，98年香港流行H5N1,我國99-2015流行H5N2、H9、H7，可用其瓊擴HA，HI。口蹄疫V：分七個型：O、A、C,SAT1(南非I型)SAT2,SAT3,和亞洲I型,不同型無交叉免疫性。,如流感病毒的變異，具體表現(xiàn)為表面抗原，它存在兩種變化形式：抗原漂移和抗原轉移,抗原漂移-是指病毒在自然宿主內頻繁傳代后

4、，所出現(xiàn)的抗原性微小變化。一般認為這是在免疫反應的壓力下，突變體選擇的結果。 抗原轉移-是指病毒抗原性突發(fā)的巨大變化。一般推測這是基因重組的結果；也有認為這是由于量變的積累而導致質變的發(fā)生 。,流感病毒的抗原變異,3培養(yǎng)特性變異: V的所謂培養(yǎng)性狀，主要指其在培養(yǎng)C上形成的蝕斑的形態(tài)和性質，實際上是V所引起的細胞病變的特征。各種V在組織培養(yǎng)C上產生的蝕斑性狀，隨V和C的種類不同而有一定差異（即使相似也有差異）。,而培養(yǎng)條件，例培養(yǎng)液和瓊脂的成分和濃度，PH，二氧化碳張力以及培養(yǎng)的T和時間，甚至培養(yǎng)容器的種類等，也對蝕斑的產生和性狀呈現(xiàn)明顯影響,動物血清和瓊脂（特別是瓊脂中的硫酸多糖）對病毒的蝕

5、斑形成具有比較明顯的抑制作用.,(1)蝕斑的大?。?決定于病毒的彌散和吸附率以及病毒在細胞內生長、成熟、釋放的速度及其在細胞內外的死亡率等但亦隨培養(yǎng)條件和時間而不同。,(2)蝕斑的色澤： 蝕斑的透明度和色澤取決于蝕斑及其周緣的細胞的死亡與溶崩情況，蝕斑中細胞完全溶崩時，蝕斑透明無色；而其中殘留較多死亡和病變細胞時，蝕斑渾濁或呈白色。而其中存留較多活細胞時，蝕斑可因著染中性紅而呈紅色。 (3)蝕斑的形狀： 蝕斑形狀的規(guī)則與否，邊緣是否清晰取決于病毒的彌散率及細胞的病變率。,4對溫度感受性的變異,是指在較低溫度下繁殖，但在較高溫度下不能繁殖，而相應的野生型在這兩種溫度都能繁殖的突變體。,5. 對化

6、學藥物的感受性變異 將鹽酸胍、羥苯丙咪唑或鹽酸金剛烷胺等病毒的滅活劑或誘變劑添加于已經(jīng)接種病毒的細胞培養(yǎng)物，經(jīng)過多次反復傳代之后，可以獲得對這些化學藥物有抗性、甚至有依賴性病毒新變種。常因編碼病毒酶基因的改變而降低了靶酶對藥物的親和力或作用，從而使病毒對藥物不敏感而能繼續(xù)增殖。 這種現(xiàn)象隨著病毒化學治療藥物的增多，耐藥現(xiàn)象可能將成為病毒化學治療中一個需要充分注意和解決的問題,6. 營養(yǎng)變異 是指病毒對某種營養(yǎng)物質反應的變異。如一種病毒必須胱氨酸的存在才能形成蝕斑，當采用培養(yǎng)液中不含胱氨酸的細胞培養(yǎng)這種病毒時，可以選育得到不需胱氨酸甚至可被胱氨酸抑制的變異株。,一、突變的概念 病毒的突變（Mut

7、ation）是指基因組中核酸堿基順序上的化學變化，可以是一個核苷酸的改變，也可為上百上千個核苷酸的缺失或易位。,突變 （Mutation）,二、病毒突變分類 一般分為自發(fā)突變和誘導突變。 （1）自發(fā)突變：是在沒有任何已知誘變劑的條件下，病毒子代產生高比例的突變體，最后導致表型變異；病毒復制中的自然突變率10-5-10-8。DNA病毒和RNA病毒在突變頻率上有較大的差別。,（2）誘導突變：是利用不同的物理或化學誘變劑（如溫度、射線、5-溴尿嘧啶、亞硝酸鹽等）處理病毒，提高病毒群體突變率，誘導病毒子代出現(xiàn)特定的突變類型。,三、突變的機理 從機理上，突變有兩種主要類型，即位點突變，缺失突變。,一）位

8、點突變 (Point mutation） 病毒的基因組通過轉錄產生mRNA，后者轉譯成結構多肽或功能多肽。如果基因組的核苷酸堿基發(fā)生了改變，即會對多肽的特性產生影響。 3個堿基組構成一個遺傳密碼。一般地講第3堿基發(fā)生了突變有時影響不大，如GGA，GGC，GGU，GGG，四個密碼轉譯的氨基酸均為甘氨酸，此稱無表型突變，假如密碼中第一或第二個堿基發(fā)生改變，則轉譯的氨基酸就會發(fā)生改變,如：GGA（甘氨酸）變成GCA（丙氨酸）和AGA（精氨酸）等。,錯義突變 ：某個氨基酸改變有時不影響pro構型和穩(wěn)定性，在此情況下，基因組的表型仍維持原狀，如果改變的氨基酸處于結構上的重要位置，那么多肽的正常功能就會喪

9、失。如GGA（甘氨酸）AGA（精氨酸）前者的側鏈是中性的，而后者的側鏈是堿性的。GGAGAA（谷氨酸），后者側鏈是酸性的，這一轉變導致多肽的構型發(fā)生嚴重影響，因而它的活性大為改變，如果是酶，則喪失了催化功能。,位點突變的特點,在單一核酸的堿基中發(fā)生了改變。 多數(shù)的點突變株為條件致死性突變株， 它只能在某些條件下增殖，但不能在另外一些條件下增殖 如：溫度敏感突變株( temperature-sensitive mutation) ： 也稱為ts突變株，其最高生長溫度比正常病毒低。28-35可以復制， 37-40不能復制。如:脊髓灰質炎減毒活疫苗。,ts 突變株常具有減低毒力而保持其免疫原性的特點

10、，是生產疫苗的理想毒株。但ts 突變株容易回復,因此制備疫苗時須經(jīng)多次誘變后，方可獲得在一定宿主細胞內穩(wěn)定傳代的突變株，亦稱變異株（variant）。脊髓灰質炎病毒活疫苗即為這種變異株。 位點突變引起的變種是多種多樣的，還如空斑大 小的變種，酶缺陷變種;,二.缺失突變,這種突變中，病毒基因組的一部分被丟失，如果這部分核酸序列是無關緊要的，則病毒的表型不會受到明顯影響，如果是關鍵部分，則病毒將失去獨立繁殖的能力，甚至是致死性 。如缺陷性干擾顆粒(defective interfering paticle，DIP)。,某些條件下，如C培養(yǎng)中，接種大量病毒并連續(xù)傳代，易感C被感染后只產生少量有感染性

11、的病毒粒子，而大量病毒粒子的基因組不完全,這種情況極普遍，幾乎所有RNA病毒和大量DNA病毒各科都有發(fā)現(xiàn)，它們對同源的完全病毒有干擾作用。,DI顆粒的特征如下：,1.病毒接種量大（MOI高），并以此連續(xù)傳代，DI顆粒逐增，而完整病毒逐減。 2.DI顆粒的產生也受宿主細胞種類控制。例NDV在CEF上傳代時DI顆粒不斷增多，而在雞胚中則不易產生。,3. DI顆粒基因組不全，用核酸指紋圖分析，核苷酸序列有各種各樣的缺失。 4. DI顆粒形態(tài)與完全（整）病毒沒有兩樣，沉降系數(shù)也變化不大，因此常污染于完全病毒制劑中，而不被察覺。,5. DI顆粒必須在完全病毒存在條件下，才繁殖，因它不能生產必須的全部功能

12、pro及結構pro。 6. DI顆粒干擾同源病毒完整粒子的生成機理尚未完全闡明，一般認為核酸鏈較短，因此復制的時間較快。 7. DI顆粒與病毒的持續(xù)性感染有密切關系，對動物體來說，DI顆?？蓽p輕發(fā)病，減少死亡，更有可能引起慢性帶毒感染。,三 插入突變,在病毒基因組中插入一段核苷酸序列。,四 抑制性突變,突變的核苷酸有可能發(fā)生回復突變。也可能因為相同甚至不同基因發(fā)生抑制性突變(suppresser mutation)，使突變逆轉，重新具有與起始毒株相同的表型。如流感病毒往往由于毫不相關的基因自行發(fā)生抑制性突變，使之失去作為弱毒疫苗的價值。,$2病毒間互相作用,一.遺傳重組 指兩種不同病毒間或同一

13、種病毒的兩個不同毒株間發(fā)生核酸交換，子代核酸序列來自兩個親代，這種現(xiàn)象一般發(fā)生于分類上很接近的兩種病毒。遺傳重組有兩種情況： 1.分子內重組：是兩種不同、通常是密切相關的兩種病毒的核酸序列的交換，DNA病毒可發(fā)生，RNA病毒也較普遍。,例如： 西部馬腦脊髓炎病毒就是： 類仙臺病毒 東部馬腦脊髓炎病毒 不同科的病毒也可發(fā)生分子內重組。 如乳多空病毒和腺病毒 病毒與宿主細胞之間也可發(fā)生分子內重組。,2.重配：主要發(fā)現(xiàn)于節(jié)段病毒，當兩種相近病毒同時感染一個細胞時，它們的基因組中有一個或幾個節(jié)段發(fā)生交換。 如：人類的流感每隔十年左右引起一次世界性大流行，可能是由于人的流感病毒與某些動物（雞、馬、豬）的

14、流感病毒間發(fā)生基因重配所致。,重組recombination,重組,重配reassortment,3、復 活,交叉復活：有傳染性的病毒與滅活的相關病毒或該病毒的DNA片段共同培養(yǎng)，產生具有滅活病毒特性的活病毒。 2)多重復活：例如用紫外線滅活的兩株同種病毒,若一同培養(yǎng)后，?？墒箿缁畹牟《緩突?，產生出感染性病毒體。 這是因為兩種病毒核酸上受損害的基因部位不同，由于重組合相互彌補而得到復活。因此現(xiàn)今不用紫外線滅活病毒制造疫苗，以防病毒復活的危險。,二.表型混合,具有某些共同特征的兩種病毒在混合感染時，有些子代的表型具有雙方親代特征，而基因型卻無變化，這種現(xiàn)象稱為表型混合。,例流感病毒和NDV等混合

15、感染同一細胞時，有些子代的囊膜抗原具有兩種親代病毒特征，囊膜病毒所顯示的表型混合，可能是一個病毒的基因組偶爾裝入另一病毒的衣殼內，或裝入兩個病毒成分構成的衣殼內，發(fā)生表型混合。這種混合是不穩(wěn)定的，傳代后可恢復其原來的特性 ； 缺陷性的羅氏肉瘤病毒的囊膜來自輔助病毒，這種里外不一致的病毒稱為假型。,無囊膜的20面體病毒中也常發(fā)現(xiàn)表型混合，例如口蹄疫病毒與一種抗原性無關的牛腸道病毒混合感染，這種現(xiàn)象稱為基因組掩蔽或衣殼交換 。 主要表現(xiàn)為耐藥性，抗原性等改變，大多基因并未改變，改變的生物學性狀不能遺傳。,表型混合示意圖,表型混合,三.互補 通常發(fā)生在兩種病毒混合感染時，由于一種病毒為另一種病毒提供

16、其必需的但又不能自己合成的基因產物，而促進了增殖；或者兩種病毒互為對方提供必需的基因產物，使雙方的增殖均有所促進。,根據(jù)參與病毒的情況，分以下幾類: (1)輔助病毒與缺損病毒的互補 (2)有活力病毒與滅活病毒互補 (3)兩株條件致死突變體間的互補 (4)病毒內互補。,四.病毒間的非遺傳相互作用,1干擾現(xiàn)象：發(fā)生于不同病毒間，也發(fā)現(xiàn)在同種病毒的不同毒株間，甚至發(fā)現(xiàn)在同種的滅活病毒與活毒之間。干擾機理可能不是單一的，下列原因都可導致干擾 ： (1) 細胞膜上的病毒受體被第一種病毒所破壞，因此第二種病毒不能吸附，這種現(xiàn)象一般發(fā)現(xiàn)在同種病毒之間。,(2) 第一種病毒封鎖了第二種病毒mRNA的轉譯，或第

17、一種病毒的核酸復制酶使第二種病毒的基因組喪失功能。 (3)DI顆粒（第一節(jié)） (4)干擾素：這是由病毒感染的宿主細胞所產生的一種抑制病毒的可溶性糖蛋白。,2. 增強作用：在某些混合感染中，一種病毒可以增強第二種病毒的生長，這種反應不但見于兩種互不相關的病毒間，也偶見于同種病毒的兩個變異株之間。 在獸醫(yī)中，牛瘟病毒可以增強牛丘疹性口炎病毒，豬瘟病毒在豬睪丸原代細胞培養(yǎng)中能增強NDV生長，此稱END試驗（豬腎原代細胞中培養(yǎng)的HEIC試驗即血凝增加病變抑制試驗），已被用于診斷NDV。有些DNA病毒能增強RNA病毒的生長。,3.互不干擾：兩種不同的病毒如侵入同一個宿主細胞，可以各自獨立地繁殖，各自產生特征性感染。,$3 缺陷V,第一節(jié)我們講了DI顆粒是因缺失突變引起不完全病毒顆粒,而自然界中存在一些天生的缺陷病毒，它們在任何條件下都不能獨立繁殖，必須依靠另一種病毒提供某些必需物質，因此后者稱為輔助病毒，前者稱衛(wèi)星病毒，它們之間具天然協(xié)助關系。例如DNA病毒中細小病毒科的依賴病毒屬，只有在腺病毒存在條件下才