基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略.ppt

1、1,基因結(jié)構(gòu)與表達(dá)分析的基本策略,Strategy for Structure and Expression Analyses of Genes,分子生物學(xué)系,2,2,分子生物學(xué)的三大核心技術(shù),DNA序列分析DNA測序，1977,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA擴(kuò)增，1985,DNA重組技術(shù)基因克隆，1973,3,一、DNA序列分析,二、核酸分子雜交,三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),四、基因芯片和微陣列,五、 Western免疫印跡,主要內(nèi)容,4,（一）雙脫氧末端終止法 (Sanger ,1977),一、DNA序列分析,（二）DNA自動化序列分析,（三）化學(xué)降解法(Gilbert ,1977),5,Frederick

2、 Sanger 1918,Walter Gilbert 1932,The Nobel Prize in Chemistry 1980,Paul Berg 1926,6,DNA測序技術(shù)基礎(chǔ)：,高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）技術(shù)，可分離差別僅1個堿基的單鏈寡核苷酸DNA片段。,7,(一）雙脫氧末端終止法（dideoxy chain termination）,8,ATP、dATP和ddATP的結(jié)構(gòu),ATP,A,OH,OH,H,H,dATP,ddATP,NTP: 核苷三磷酸ATP、GTP、 CTP、 UTP的合稱； d

3、NTP: 脫氧核苷三磷酸dATP、dGTP 、dCTP、dTTP； ddNTP: ddATP、ddGTP、ddCTP 、ddTTP；,9,摻入N個核苷酸,DNA合成反應(yīng)模式圖,10,DNA單鏈模板,引物,摻入ddNTP,延伸的新合成鏈,末端終止,11,1. 雙脫氧末端終止法原理,DNA合成反應(yīng)中，ddNTP不存在3-OH末端，故不能與下一個核苷酸的5-磷酸基團(tuán)形成3，5-磷酸二酯鍵，導(dǎo)致DNA新鏈的延伸提前終止于ddNTP 。,12,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,A G C T,5 T,4,7,11,G A A T G A 3,A,C,

4、G,C,T,13,2. DNA測序主要步驟,14,G反應(yīng)管,T反應(yīng)管,15,16,G A T C,17, 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 單鏈DNA模板的制備, DNA模板與測序引物退火, 摻入法標(biāo)記反應(yīng), 延伸-終止反應(yīng), 放射自顯影, 閱讀測序結(jié)果,測序步驟,18,（二）DNA測序自動化原理,采用4種不同的熒光分別標(biāo)記4種ddNTP終止反應(yīng)產(chǎn)物，替代放射性同位素標(biāo)記是實現(xiàn)DNA測序自動化的基礎(chǔ)。,19,ddCTP,ddATP,ddTTP,ddGTP,dCTP,dATP,dTTP,dGTP,20,21,表示一個SNP位點，該位點出現(xiàn)了雙峰，對應(yīng)的核苷酸分別為C和T,因此該位點為CT雜合型，如果該位

5、點只有一個峰C或者T，則該位點基因型為CC或TT純合型,22,DNA自動測序步驟,4種不同熒光染料標(biāo)記終止物ddNTPs,Sanger測序反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物同一泳道電泳分離,激光激發(fā)不同大小DNA片段上的熒光分子，發(fā)射出四種不同波長的熒光,熒光信號采集、計算機(jī)分析與DNA自動排序,23,Dye labeled dideoxyterminators on ABI 3730 capillaries,24,25,26,化學(xué)降解G反應(yīng)模式圖,Met,Met,Met,Met,27,最新測序技術(shù),454技術(shù)(Roche ) 焦磷酸測序（Pyrosequencing） Solexa測序技術(shù)(Illumina )

6、 SOLiD技術(shù)(ABI ) 連接法測序,28,舉例：Solexa測序,HiSeq 2000,29,Solexa 測序：在一個反應(yīng)中同時加入 4 種核苷的標(biāo)簽，采用邊合成邊測序（ SBS sequencing by synthesis ）。,完成人類基因組草圖不同測序儀的比較圖,30,二、核酸分子雜交,（Nucleic Acid Hybridization ）,（一）Southern印跡雜交：檢測DNA (Southern blot hybridization) Southern EM , 1975,（二）Northern印跡雜交：檢測RNA (Northern blot hybridizat

7、ion) Stark GR，1977,31,核酸分子雜交原理,標(biāo)記的單鏈核酸探針與待檢測的靶單鏈DNA或RNA局部互補(bǔ)結(jié)合形成雜交雙鏈。,應(yīng)用：核酸靶DNA或RNA序列的定性與定量分析。,32,33,33,印跡技術(shù) 利用各種物理方法使電泳膠中的生物大分子轉(zhuǎn)移到NC等各種膜上，使之成為固相化分子。 這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為“blotting”, 譯為印跡技術(shù)。,34,34,探針技術(shù) 用放射性核素、生物素或熒光染料標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針”。 探針可以與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。,35,Southern印跡雜交原

8、理,將電泳分離的待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。,（一）Southern印跡雜交,應(yīng)用：DNA（基因組DNA）分子的定性或定 量分析。,36,1. 制備基因組DNA 2. 用限制性內(nèi)切核酸酶消化基因組DNA 3. 瓊脂糖凝膠電泳分離DNA酶切片段 4. 凝膠預(yù)處理（如強(qiáng)堿，DNA雙鏈變?yōu)閱捂湥?5. Southern 印跡轉(zhuǎn)移 6. 標(biāo)記核酸探針、探針與DNA片段雜交 7. 雜交結(jié)果顯示,Southern印跡雜交基本過程,37,Southern印跡雜交示意圖,38,將電泳分離的待測DNA片段結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記

9、的核酸探針進(jìn)行雜交的過程。,39,40,地中海貧血的Southern blot 基因診斷,（1）僅一條染色體上的一個基因缺失或缺陷，則鏈的合成部分受抑制，稱為+地貧； （2）每條染色體上的2個基因均缺失或缺陷，稱為0地貧； (3) 1、2序列基本一致； 基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。,1,2,+, + +,0, + 0, 0 0,41,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,地中海貧血的直接基因診斷,42,/ /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,43,（二）Northern印跡雜交 (North

10、ern blot hybridization),指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 用于mRNA進(jìn)行定性和定量分析。,44,RNA瓊脂糖凝膠電泳,Northern blot hybridization,應(yīng)用舉例,45,Northern blot 雜交分析mRNA的表達(dá),靶 mRNA,3-磷酸甘油醛脫氫酶,46,46,三、其他雜交技術(shù),1. 斑點雜交 (dot blot hybridization）,將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)的定性及定量研究。,47,47,2.原位雜交（

11、in situ hybridization）,用標(biāo)記的核酸探針與組織切片或細(xì)胞中的待測核酸互補(bǔ)序列雜交，可對核酸進(jìn)行定性、定位和相對定量分析。,48,3核酸酶S1 保護(hù)分析法 (nuclease S1 protection assay） 單鏈DNA探針與待測RNA形成DNA/RNA雜交雙鏈，加入核酸酶S1專一性地降解未形成雜交體的DNA或RNA單鏈，DNA/RNA雜交雙鏈則受到保護(hù)而不被降解。,49,4RNA酶保護(hù)分析法 （RNase protection assay，RPA）,50,RPA基本程序：,待測RNA的分離 體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA探針 待測RNA與探針RNA進(jìn)行液相雜交 RNA酶消化

12、不同大小雜交片段凝膠電泳分離,51,三、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),(Polymerase Chain Reaction, PCR),（一）PCR技術(shù)原理,（二）耐熱DNA聚合酶,（三）PCR引物及設(shè)計原則,（四）PCR條件的優(yōu)化,（五）PCR改進(jìn)技術(shù),（六）其它PCR技術(shù),52,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) :,（一）PCR技術(shù)原理,53,The replication of DNA,54,原理：PCR是模擬天然DNA復(fù)制過程，利用DNA 聚合酶催化一對引物間特異DNA片段合成的體外擴(kuò)增技術(shù)。 其主要熱循環(huán)過程為：變性、退火、延伸三個步驟。,55,1. PCR循環(huán)由三步組成：,變性（denaturation

13、）,退火（annealing）,延伸（extension）,高溫,合適溫度,合適溫度,56,57,58,2. PCR擴(kuò)增終產(chǎn)物大小:,介于兩條退火引物5末端之間的雙鏈DNA片段。,循環(huán)一,59,循環(huán)二,60,循環(huán)三,61,一對引物：正向和反向限制了PCR擴(kuò)增的片段的范圍,62,5CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCG

14、TGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGCG 3,GGTCCAGTACTACTACCCGT,AGAACATGGTGCGCAGGTT,3. 引物設(shè)計實例,63,Y=A（1+E）n Y: 擴(kuò)增產(chǎn)物的量 A: 最初靶DNA分子數(shù) E: PCR擴(kuò)增效率 n: 循環(huán)次數(shù),3. PCR產(chǎn)量,當(dāng)E10

15、0, A=1時 Y=2n 2n(引物延伸產(chǎn)物的量）,64,（二）平臺期與平臺效應(yīng),1. 平臺效應(yīng)（plateau effect）： PCR經(jīng)過一定數(shù)量的循環(huán)后，DNA片段不再呈指數(shù)累積，而是進(jìn)入線性增長期或靜止期，即平臺效應(yīng)。,影響因素： 引物及dNTP底物濃度降低。 酶與模板比例下降。,65,PCR平臺效應(yīng),66,（二）耐熱DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶（實現(xiàn)了PCR自動化）,從嗜熱水生菌thermus aquatics YT-1株中直接分離出來。, 95的半衰期: 40 min 最適溫度: 72 80 催化反應(yīng)速率: 150300核苷酸 / 秒/ 酶分子,67,68,Taq DNA聚合

16、酶特性：, 53聚合酶活性； 53外切酶活性； 較弱的非模板依賴性； 缺乏35外切酶活性。,69,PCR thermal cycler,70,PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析,500bp,400bp,200bp,300bp,1000bp,600bp,700bp,800bp,900bp,Marker,PCR產(chǎn)物,71,無機(jī)離子及抑制劑的影響,Taq DNA聚合酶的活性對Mg 2+ 濃度和單價離子（K+或NH4+）的性質(zhì)和濃度較敏感。,最適Mg 2+濃度：2 mmol/L K+濃度：50 mmol/L,72,幾種高保真的耐熱DNA聚合酶,1. Tth DNA聚合酶 2. Vent DNA聚合酶 3.

17、 Pfu DNA聚合酶,73,（三）PCR引物設(shè)計原則,引物的化學(xué)本質(zhì)是什么？,單鏈寡核苷酸DNA或RNA片段。,DNA復(fù)制引物：單鏈RNA片段,PCR引物： 單鏈DNA片段,74,PCR引物設(shè)計原則： 1.引物與模板的序列要完全互補(bǔ) 2.引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu) 3.引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(錯配),75,5CACTGAACGTAGGCCT3,3GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5,特異擴(kuò)增,5CACTGAACGTAGGCCT3,3GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5,錯誤引發(fā),1. 引物與模板的

18、序列要緊密互補(bǔ),2. 引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反應(yīng)(錯配),76,引物之間應(yīng)避免3端互補(bǔ),3.引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu),77,引物自身不應(yīng)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),78,4.其它原則:, 引物長度: 1030 nt, 堿基分布: A、T、G、C 隨機(jī)分布, G+C含量：40 60% Tm=4(G+C)+2(A+T), 引物3末端堿基：最好選T、C、G，不選A,避免出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC, 引物5末端堿基可不與模板DNA互補(bǔ),79,1 A260 oligo DNA33g N: 引物堿基數(shù) X：合成的oligo DNA A260單位 Y：引物的pmol數(shù)

19、,106 Y（pmol）= X33 330 . N X = 105 N,2. 引物用量計算,80,模板 引物 Taq DNA聚合酶 dNTP Mg2+,退火,變性,延伸,PCR反應(yīng),81,（四）PCR條件的優(yōu)化,1. Taq DNA聚合酶濃度： 1.02.5 U/100 l反應(yīng)液,2. dNTP濃度：20200 mol/L,3. Mg2+濃度：0.52.5 mmol/L,4. 引物濃度：0.10.5 mol/L,82,（五）PCR改進(jìn)技術(shù),1. RT-PCR (reverse transcription PCR),以mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。,83,

20、RT-PCR原理,84,逆轉(zhuǎn)錄酶, AMV（avian myeloblastosis virus） 酶活性最適溫度42 , MMLV（Moloney murine leukemia virus）：最適溫度37 ,85,2. 定量RT-PCR（QRT-PCR）,半定量RT-PCR,以樣本mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在不同引物對引導(dǎo)下共同PCR擴(kuò)增“看家”基因和目的基因cDNA 。,86, 選擇內(nèi)對照基因 組織中普遍表達(dá)、表達(dá)量比較恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和 -actin mRNA等。, 半定量標(biāo)準(zhǔn) 計算PCR 產(chǎn)物 ： 靶cDNA /GAPDH cDNA,87, KPNA2

21、在正常生理狀態(tài)東方田鼠和小鼠體內(nèi)表達(dá)分析,88,89,3. 實時熒光定量RT-PCRReal-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR,PCR擴(kuò)增指數(shù)期內(nèi)極小的擴(kuò)增效率改變會極大地影響產(chǎn)量。 應(yīng)用：用于基因DNA拷貝數(shù)和mRNA表達(dá)定量分析。,90,熒光染料,91,92,每形成一個DNA雙鏈，就有一定數(shù)量的染料結(jié)合上去，染料一結(jié)合就產(chǎn)生熒光信號，信號強(qiáng)度與DNA分子總數(shù)目成正比。,93, TaqMan Probe,一種水解式熒光標(biāo)記探針。寡核苷酸探針的5端標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)（reporter ），3端標(biāo)記一個熒光淬滅基團(tuán)（quencher ）。,94,

22、每產(chǎn)生一條DNA鏈，就切斷一條探針，每切斷一條探針，就產(chǎn)生一個單位信號，信號強(qiáng)度與結(jié)合探針的DNA分子數(shù)成正比。,95,。, 分子信標(biāo)探針（Molecular Beacon Probe）,該探針具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，5端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。,96,探針與靶序列雜交結(jié)合，報告熒光染料與淬滅染料分離，發(fā)出熒光。,97,實時熒光定量PCR計算原理,PCR擴(kuò)增效率的差異使相同的樣品最終產(chǎn)量有很大差異,98,99,CT或Tc或Ct值：,臨界點循環(huán)（Threshold cycle ），即從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)數(shù),100,101, 傳染病診斷、監(jiān)測與療效預(yù)后評估： 揭示疾病發(fā)病機(jī)制,102, 熒光定量 PCR儀 帶有激發(fā)光源和熒光信號檢測系統(tǒng)的PCR儀