sanger測序培訓PPT最終.ppt

1、sanger測序-基因檢測的金標準,曹尚志,1,sanger測序原理,Sanger測序的基本流程,測序結(jié)果的分析,雙脫氧末端終止法,引物設計 實驗流程 上機測序,怎樣分析結(jié)果 問題峰圖分析,2,ddNTP被加到正在合成的鏈上，由于它的3-OH已被氧化，下一個dNTP的5-磷酸基團不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。 在引物等延伸反應過程中，ddNTP在不同位置摻入，產(chǎn)生了一系列不同長度的新的DNA片段。,5,3,5,3,一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法,3,一、Sanger測序原理雙脫氧末端終止法,4,二、Sanger測序的實驗基本流程（以MTHFR(RS1801133)檢測為例）,1

2、.根據(jù)rs號得到位點信息及目標序列,2.引物設計,3.測序PCR模板的制備,4. 測序樣品的制備,5.上機測序,5,1.根據(jù)rs號得到位點信息及目標序列,6,+,2.1 primer primer 5.0,2.引物設計,7,2.2 引物特異性檢查,2.引物設計,8,避免3端錯配,Your Text Here,避免熒光標記,測序引物長度16-25bp，TM值50-65為宜,55最佳,測序引物位置避免Poly（A.T）和高GC結(jié)構(gòu),測序引物位置距離位點最多600bp，至少50bp,不能使用兼并引物測序,引物純度（PAGE純化方式）,2.3 設計引物還需注意,9,3.測序PCR模板的制備,根據(jù)合成回

3、來的引物濃度稀釋，一般工作液10umol/ul(4保存)，母液100umol/ul（-20保存）,1.PCR擴增三步法：變性-退火-延伸 2.退火溫度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸時間：1kb=1min,根據(jù)設計好的參數(shù)，設置使用PCR儀器擴增.,3.1 PCR擴增,稀釋引物,設計方案,pcr儀擴增,10,依賴于 PCR反應的優(yōu)化程 PCR產(chǎn)物的質(zhì)量 選擇最佳的純化方法,純化的意義,純化（試劑盒） 方式選擇,1.柱純化：用于特異PCR產(chǎn)物純化或存在100bp的非特異產(chǎn)物的純化 (如：引物二聚體) 2.切膠回收：可用于任何質(zhì)量的PCR產(chǎn)物純化切下條帶，去除非特異PCR產(chǎn)物和引物二聚體,3

4、.2 PCR產(chǎn)物純化,去除PCR反應液的殘留,1.殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測序 2.殘留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳比例 3.鹽成分：避免抑制測序酶活性 4.非特異PCR產(chǎn)物：避免擴增出同源性區(qū)域,11,測序PCR,酒精/EDTA/NaAc法：去除殘留的BigDye Terminator(染料峰) 測序產(chǎn)物脫鹽 純化好的測序產(chǎn)物比較穩(wěn)定,測序產(chǎn)物純化,4.測序樣品制備,測序PCR（以回收PCR產(chǎn)物為模板）：96 1 min -(96 10 sec - 50 5 sec - 60 4 min) x 25循環(huán)-4 保溫,12,13,測序PCR與普通PCR的區(qū)別,

5、14,5. 上機測序,pcr擴增儀器中95變性4min。.,5.1 測序樣品變性,5.2 上機操作,15,三、 測序結(jié)果分析,怎樣看測序結(jié)果,怎樣得到位點基因型,常見峰圖介紹,保證測序結(jié)果的準確性,16,峰圖判斷三要素：電泳圖(Electropherogram)、峰圖(Raw)、QV值,峰圖,電泳圖/QV值,1.怎么看峰圖（分析軟件Sequence Analysis）,17,Raw：峰圖,Electropherogram：電泳圖,18,QV值 QV值越高，讀圖越準確。 QV值為藍色，表示可信。 QV值為黃色，表示不準確，需要人工判讀。 QV值為紅色，表示不可信,QV值,19,根據(jù)得到位點信息，

6、將位點3保守序列（10個堿基左右），在軟件中Chromas查找，前面即為突變基因型。 PS:如果是反向引物測序需要將測序結(jié)果反向互補,2.怎樣得到位點基因型（分析軟件Chromas）,20,正常及無信號、信號弱測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,21,正常峰圖（有完整峰型、單一峰尖銳獨立、QV值基本上為藍色),Electropherogram：,Raw：,22,無信號（無完整峰型、無信號或信號值較低、峰圖雜亂無章、絕大部分不可信）,Raw：,Electropherogram：,23,信號弱（有較完

7、整峰型、信號值較低、峰圖部分可信）,Raw：,Electropherogram：,24,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,25,poly（A、T）結(jié)構(gòu)導致后雙峰,返回,Electropherogram：,Raw：,26,測序信號中斷（二級結(jié)構(gòu)導致）,返回,Electropherogram：,Raw：,27,序列結(jié)構(gòu)高GC導致信號衰減,返回,Electropherogram：,Raw：,28,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰

8、圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,29,峰圖出現(xiàn)斷層（可先重跑看是否解決，需要換Buffer）,Electropherogram（電泳圖、QV正常）,Raw：,30,毛細管堵塞導致拖尾（可先重跑看是否解決，或者清理毛細管）,Electropherogram（展開圖正常）,Raw：,31,毛細管堵塞導致寬峰（可先重跑看是否解決，或者清理毛細管）,Electropherogram：,Raw：,32,正常及無信號測序峰圖 樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測序峰圖 測序儀器影響及測序峰圖 純化因素影響及測序峰圖 引物質(zhì)量影響及測序峰圖,3.常見峰圖介紹及分析,33,染料峰（純化操作不規(guī)范或者ddntp過量）,返回,Electropherogram：,Raw：,34,正常及無