《谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶》PPT課件.ppt

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶,南京工業(yè)大學(xué) 2011級(jí)食品科學(xué) 汪開銀,目錄,第一、介紹 第二、分離與純化 第三、理化性質(zhì)的研究 第四、應(yīng)用前景,第一、介紹,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶( Transglutaminase，EC2 3 213，簡(jiǎn)稱TGase) 是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶。它具有多種催化功能，能催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)、分子間發(fā)生交聯(lián)、蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)，從而直接改變蛋白質(zhì)本身及蛋白質(zhì)所附著的細(xì)胞、組織等的結(jié)構(gòu)和功能特性。 因此，TGase 在食品、生物醫(yī)藥、組織工程、紡織和皮革工業(yè)中都有著廣泛的應(yīng)用前景。,第二、分離與純化,1.1 主要儀器和試劑 J2-MC 微控高

2、速冷凍離心機(jī)；ImageMaster VDS 膠成像分析系統(tǒng)；冷凍干燥機(jī)。 N-CBZ-Gln-Gly、L-谷氨酸-單羥肟酸、還原型 谷胱甘肽、羥胺。 香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇等。,1.2 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活測(cè)定方法,Grossowicz 比色法測(cè)定酶活力， 以N-CBZ-Gln-Gly 和羥胺為作用底物， 以L-谷氨酸-單羥肟酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。一個(gè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活力單位定義為：37 時(shí)每分鐘催化形成1 mol L-谷氨酸-單羥肟酸的酶量為一個(gè)酶單位。 從標(biāo)準(zhǔn)曲線求出酶活： 酶活力/（U /mL）=7.983 5A525稀釋倍數(shù)/10,1.3 提取,經(jīng)過(guò)初步試驗(yàn)，確定食用菌中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種

3、胞外酶。從新鮮香菇子實(shí)體中提取谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的工藝流程為：,分別測(cè)定香菇、平菇、金針菇、杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗提液的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性，結(jié)果分別為0.261、0.116、0.115、0.276 U/mL?？梢姴煌N的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性有較大的差異，香菇和杏鮑菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶酶活性較強(qiáng)，平菇、金針菇的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的酶活性較弱，從它們的比活性來(lái)看，杏鮑菇最高，但市場(chǎng)上杏鮑菇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比香菇貴，且香菇容易獲得，所以選用香菇作為以后的試驗(yàn)材料。,超濾方法 采用WB-3 型的中空纖維膜， 截留分子量為30 000 u，在加冰冷卻的條件下，保持泵出水壓為0.4MPa，對(duì)粗酶濾液進(jìn)行超濾循環(huán)

4、，直到達(dá)到相應(yīng)的濃縮倍數(shù)，收集濃縮液。,乙醇沉淀 取粗提取液100 mL，按V（提取液）V（乙醇）=11；V（提取液）V （乙醇）=11.5；V（提取液）V（乙醇）=12體積分?jǐn)?shù)比分別加入經(jīng)預(yù)冷至0 的95 乙醇，迅速攪拌，將混和液離心（3 ，10 000 r/min，10 min），所得沉淀用0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液（pH6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100 mL，測(cè)定酶活，計(jì)算酶活收率。 （酶活收率分別為40 、387 、408 ） 丙酮沉淀法 實(shí)驗(yàn)方法與乙醇相同。 （酶活收率為59.2 ）,飽和硫酸銨沉淀 室溫下， 加不同量的硫酸銨到100 mL

5、經(jīng)超濾后的提取液（預(yù)冷至0）中，形成濃度為20、40、60、80的硫酸銨溶液，保持6 h 后，離心（10 000 r/min、3、5 min）， 將所得沉淀用0.2 mol/L Tris -HCl 緩沖液（pH6.0）溶解，再次以相同的條件離心，取上清液定容于100mL，測(cè)定酶活，計(jì)算酶活收率。（在60%時(shí)酶活最高，達(dá)到56.9%）,不同沉淀法對(duì)酶收率的影響 分別采用60 %飽和硫酸銨沉淀、95 %乙醇與丙酮沉淀法對(duì)粗酶進(jìn)行沉淀分離，3 種沉淀法的酶活收率分別為569 %、436 %、59.2 %。 結(jié)果表明用丙酮和飽和硫酸銨沉淀的酶活收率要比乙醇沉淀酶活收率稍高一些。但是飽和硫酸銨沉淀法在酶

6、液中引入了水溶性無(wú)機(jī)鹽， 需要進(jìn)行脫鹽等步驟，較繁瑣。有機(jī)溶劑沉淀法則不需脫鹽及多次分離等步驟，過(guò)程短，且其為揮發(fā)性液體，在干燥中可揮發(fā)成氣體而不殘留， 或僅留其痕跡。而考慮到作為食品用酶，最好不用丙酮沉淀法，所以最終采用乙醇沉淀。,第三、理化性質(zhì)的研究,3.1 粗酶的最適溫度 冷凍干燥后的粗酶制成酶液分別在20、30、40、50、60 下測(cè)定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100 %。 3.2 溫度對(duì)粗酶穩(wěn)定性的影響 冷凍干燥后的粗酶制成酶液， 分別在20、30、40、50、60 的水浴中保留10 min，用冰浴快速冷卻，然后在37下測(cè)定酶活，以未經(jīng)處理的酶液酶活為100%。 3.3 pH 對(duì)粗酶穩(wěn)定性

7、的影響 分別將酶液pH 值調(diào)節(jié)至（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）， 于4 放置12 h， 取出調(diào)節(jié)各樣品的pH 至6.0，37 測(cè)定各樣品酶活， 以未經(jīng)處理的酶液酶活為100 %。計(jì)算相對(duì)酶活，得出曲線。 3.4 粗酶的最適pH 將酶液的pH 值調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 測(cè)定酶活， 以最高點(diǎn)相對(duì)酶活為100 %，作出曲線。,3.5 金屬離子對(duì)酶活的影響 在酶反應(yīng)體系中分別加入相同濃度（1 mg/L）的各種金屬離子（Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cu2+），37 保溫10 min測(cè)定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活。以不加

8、任何金屬離子的酶活為參照。 3.6 底物濃度對(duì)反應(yīng)速度影響 分別加入底物（0.03 mol/L） 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，每支試管各加入0.2 mL 濃縮酶液，37 反應(yīng)10 min，各管加0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液至1.6 mL，分別測(cè)定酶活性，求出反應(yīng)速率，采用Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)法求得米氏常數(shù)Km 和最大反應(yīng)速率Vmax。 3.7 純酶的最適溫度 取濃縮酶液，分別在20、30、40、50、60 下測(cè)定酶活，以最高點(diǎn)酶活為100 %。,由圖2 可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶的最適溫度在40 左右， 在30 50 范圍內(nèi)有較高活

9、性，當(dāng)溫度大于50 后活性急劇下降。,從圖3 可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶在50 以下保持其穩(wěn)定性，高于50 時(shí)酶的穩(wěn)定性變差，活性喪失較快。這是因?yàn)槊冈诜€(wěn)定升高到一定限度時(shí)，就會(huì)發(fā)生高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化失去部分催化活性， 酶發(fā)生的肽鏈伸展隨穩(wěn)定不同而有不同的伸展速度，溫度越高，肽鏈伸展加深，直至變性，完全失去活性。,由圖4 可見，香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的最適反應(yīng)pH為6.0。,從圖5 可看出，粗酶在pH5.07.0 左右穩(wěn)定性最好。,結(jié)果如表2 所示，離子強(qiáng)度對(duì)酶活的影響不大,由圖6 可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增加，酶促反應(yīng)速度顯著加快， 當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.5 g/L時(shí)反應(yīng)速度不再顯著增加

10、，酶促反應(yīng)速率接近Vmax。 做Lineweaver-Burk 圖（圖7），根據(jù)測(cè)定結(jié)果得到米氏方程1/V=74.5931/S+49.07，Vmax=0.020 g/（Lmin），米氏常數(shù)Km=1.520 g/L。,從圖8 可以看出， 純酶的相對(duì)酶活溫度曲線與粗酶大致相同，最適溫度也在40 左右，但在30 50 的范圍內(nèi)都具有較高的酶活性。,3.8 結(jié)論 香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶和純酶酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果顯示：香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶最適溫度為40，溫度穩(wěn)定范圍在50 以下，最適pH 6.0，pH 穩(wěn)定范圍為pH5.07.0。香菇谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶酶促反應(yīng)的Vmax 為0.020 g/（Lmin），米氏常

11、數(shù)Km 為1.520 g/L 。Na+、Ca2+、Pb2+、K+、Mg2+、Cu2+ 等離子對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶粗酶酶活影響甚微，該酶為非Ca2+依賴性酶。,第四、應(yīng)用前景,谷氨酰胺酶在食品、醫(yī)藥（研究癌細(xì)胞方面）、紡織（如改善羊毛制品性能）等方面都有廣闊的應(yīng)用前景，其中在食品行業(yè)應(yīng)用最受關(guān)注。 4.1 在肉制品中的應(yīng)用 肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是肌肉的重要組成成分，是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物。在肉制品加熱時(shí)，彼此間能夠形成二硫鍵，對(duì)維持肉制品的保水性和粘彈性等方面起著重要的作用。在肉制品中加入谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，經(jīng)催化反應(yīng)在肌肉蛋白質(zhì)分子間形成的共價(jià)鍵的作用力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于二硫鍵，能使蛋白質(zhì)更緊密地結(jié)合在一

12、起，形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，顯著提高了產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)、改善了肉制品品質(zhì)、增加了產(chǎn)品的附加價(jià)值。 4.2 在乳制品中的應(yīng)用 乳制品中的酪蛋白、乳清蛋白、乳球蛋白等是谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶作用的良好底物，所以谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶在乳制品加工中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。牛乳酪蛋白是重要的食品蛋白質(zhì)，在許多食品的加工中，加入酪蛋白可以改善產(chǎn)品的品質(zhì)9。經(jīng)過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶改性后的酪蛋白，在功能性質(zhì)方面得到顯著增強(qiáng)，是優(yōu)良的食品添加劑，可應(yīng)用于焙烤食品、冰淇淋，也可作為脂肪的替代物，用于香腸、重組肉制品、魚制品。,4.3 在水產(chǎn)品中的應(yīng)用 魚肉在低溫下可形成凝膠，這與其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量有關(guān)。新鮮的魚含有較多的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶，可以生產(chǎn)出高品質(zhì)的魚凝膠制品，但經(jīng)過(guò)冷凍貯藏后的魚，其內(nèi)源性谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的含量隨新鮮程度的下降而減少，因此可以通過(guò)加入谷氨酰