高效制備感受態(tài)

1、在科研實(shí)驗(yàn)中，為了獲得純的重組質(zhì)粒DNA，需要允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變，成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的細(xì)胞，即感受態(tài)細(xì)胞。基本制備步驟1.從37培養(yǎng)16-20 h的平板中挑取一個(gè)單菌落(直徑2-3 mm)，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100 ml LB或SOB培養(yǎng)基的1L燒瓶中。于37劇烈振搖培養(yǎng)3 h。一般經(jīng)驗(yàn)，1 OD600約含有大腸桿菌DH5 109 個(gè)/mL。2.將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)無(wú)菌、一次性使用的、用冰預(yù)冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至0。3.于4用Sorvall GS3特頭（或與之

2、相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以4 100 r/min離心10 min，以回收細(xì)胞。4.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。5.每50 ml初始培養(yǎng)液用30 ml預(yù)冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細(xì)胞沉淀。6.于4用Sorvall GS3轉(zhuǎn)頭（或與之相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭）以41 00 r/min離心10 min，以回收細(xì)胞。7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1 min以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡。8.每50 ml初始培養(yǎng)物用2 ml用冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細(xì)胞沉淀。9.此時(shí)，可以用新鮮制備的

3、感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可以將細(xì)胞凍存于- 70。潔凈是最重要的無(wú)菌都無(wú)所謂，在操作臺(tái)上可正常操作。離心力要注意不要超過(guò)2500g,建議1500-2000g 5min。涂板要注意，不要覺(jué)得不勻而多次反復(fù)。輕輕在平板上帶一下感覺(jué)板上大部分地方走過(guò)即可，特別在冰箱中保存過(guò)或在溫箱中溫浴2小時(shí)以上的板。涂完后建議空氣晾干（20-30分鐘）這樣會(huì)減少衛(wèi)星菌落出現(xiàn)。預(yù)冷是必要的。整個(gè)過(guò)程的低溫也并非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時(shí)經(jīng)常在室溫倒置1min，對(duì)感受態(tài)效率提高有幫助，第一次多加一點(diǎn)緩沖液，我經(jīng)常加至20ml，效果不錯(cuò)。關(guān)于感受態(tài)的制備方法關(guān)于大腸桿菌的感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化的方法很多，最復(fù)

4、雜的莫過(guò)于電轉(zhuǎn)化，而最簡(jiǎn)單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩沖液的EP管冰箱即開始轉(zhuǎn)化。對(duì)于做克隆工作的人而言，高而穩(wěn)定的感受態(tài)可減輕不少麻煩。東澳大腸桿菌感受態(tài)列表BL21(DE3)chemically Competent Cell產(chǎn)品特點(diǎn)：BL21菌株用于以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達(dá)受控于噬菌體DE3區(qū)的lacUV5啟動(dòng)子，該區(qū)整合于BL21的染色體上。該菌適合于非毒性蛋白的表達(dá)。DH5 Chemically Competent Cell產(chǎn)品特點(diǎn)：大腸桿菌DH5是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?，在使用pUC系列質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化時(shí)，可

5、與載體編碼的-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)-互補(bǔ)?？捎糜谒{(lán)白斑篩選鑒別重組菌株。STBL3 Chemically Competent Cell產(chǎn)品特點(diǎn)：STBL3感受態(tài)細(xì)胞是慢病毒載體系統(tǒng)推薦使用的菌株，可有效抑制長(zhǎng)片段末端重復(fù)區(qū)的重組，降低錯(cuò)誤重組的概率。Top 10 Chemically Competent Cell產(chǎn)品特點(diǎn)：TOP10感受態(tài)細(xì)胞是一種常用于質(zhì)?？寺〉木?，適用于高效的質(zhì)粒DNA克隆并能保證高拷貝質(zhì)粒的穩(wěn)定復(fù)制。使用方法：1 從-70 超低溫冰箱中取出一管感受態(tài)菌，冰浴10 min使其解凍；2 加入適量目的質(zhì)粒DNA，冰浴30 min；3 插入42水浴中90S進(jìn)行熱休克，然后冰浴5 min；4 加入0.7ml無(wú)抗LB培養(yǎng)基（培養(yǎng)基預(yù)熱至37），然后37 160-180rpm/min震蕩培養(yǎng)45-60min；5 取上述轉(zhuǎn)化混合液100-300l，在含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿上用玻璃涂布棒涂布均勻；6 *如果載體和宿主