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1、細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng),南醫(yī)大三附院檢驗(yàn)科 江培濤,常用試驗(yàn),碳水化合物的代謝試驗(yàn) 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn) 碳源和氮源利用試驗(yàn) 各種酶類試驗(yàn) 抑菌試驗(yàn),一 碳水化合物的代謝試驗(yàn),1 糖(醇、苷)類發(fā)酵試驗(yàn) 原理:細(xì)菌含有發(fā)酵糖(醇、苷)的酶分解糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、或僅產(chǎn)酸 培養(yǎng)基:含有0.5%1%的糖(醇、苷)的液體、半固體、固體、或 微量生化管 方法: 純菌種接種培養(yǎng)基,要求的溫度,數(shù)小時(shí)至兩周,微量管注意保持濕潤,以免干燥 結(jié)果:能分解糖(醇、苷)類產(chǎn)酸時(shí),培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng) 若能產(chǎn)氣時(shí),培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂氣泡等現(xiàn)象 意義:腸桿菌科尤為重要,2 氧化-發(fā)酵試驗(yàn)(O/F),原理:細(xì)菌分解葡萄
2、糖的過程中,必須有分子氧參加的,稱為氧化型;可以進(jìn)行無氧降解的,稱為發(fā)酵型;不分解葡萄糖的稱為產(chǎn)堿型 培養(yǎng)基:HL二氏培養(yǎng)基 方法;待測(cè)菌同時(shí)接種兩只HL培養(yǎng)基,其中一只滴加無菌的液體石蠟,高度不少于1cm,35培養(yǎng)48h或更長 結(jié)果:兩只均無變化為產(chǎn)堿型;兩只均產(chǎn)酸為發(fā)酵型;僅不加石蠟的產(chǎn)酸為氧化型 意義:腸桿菌科與非發(fā)酵菌的鑒別;葡萄球菌與微球菌的鑒別,前者為發(fā)酵型,后者為氧化型,3 ONPG(半乳糖苷酶試驗(yàn)),原理:有的細(xì)菌可以產(chǎn)生半乳糖苷酶,分解鄰-硝基酚- 半乳糖苷生成黃色的鄰-硝基酚 方法:從KIA上取菌,于0.25ML無菌生理鹽水中制菌懸液,加甲苯一滴,使酶釋放。37 水浴5mi
3、n,加0.25mlONPG試劑,水浴20min-3h觀察結(jié)果 結(jié)果:呈現(xiàn)黃色為陽性,一般20-30min內(nèi)顯色 意義:迅速及遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陽性,不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定 注意:該試驗(yàn)不一定與分解乳糖相一致,決定于細(xì)菌產(chǎn)生的酶及其活性,七葉苷水解試驗(yàn),原理:有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素,后者與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價(jià)鐵離子反應(yīng)生成黑色化合物,使培養(yǎng)基呈黑色 方法:將待測(cè)菌接種于七葉苷培養(yǎng)基,培養(yǎng)后觀察結(jié)果 結(jié)果:培養(yǎng)基變黑為陽性,不變?yōu)殛幮?意義:D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別,前者為陽性;肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌多陽性,V-P試驗(yàn),原理:細(xì)
4、菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,后者脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇,乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰,進(jìn)而與培養(yǎng)基中蛋白胨內(nèi)精氨酸中的胍基作用,生成紅色化合物,即為V-P試驗(yàn)陽性。奈酚可加速此反應(yīng) 培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 48h,加入甲液(6%奈酚酒精溶液)和乙液(40 %KOH溶液) 結(jié)果:20min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性,如無紅色,且于35 4h 后仍如故即為陰性 意義:本試驗(yàn)常與甲基紅一起試驗(yàn),前者陽性則后者多陰性,甲基紅試驗(yàn),原理:細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸,后者進(jìn)一步生成甲酸、乙酸、乳酸等,使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下,加入甲基紅試劑后顯紅色即陽性。若產(chǎn)酸量少,或進(jìn)一步轉(zhuǎn)
5、化為其他物質(zhì),則培養(yǎng)基的PH仍在6.2以上,加入甲基紅試劑后顯黃色,為陰性 培養(yǎng)基:葡萄糖蛋白胨水 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,2-4天后,加入甲基紅試劑,觀察結(jié)果 結(jié)果:呈現(xiàn)紅色為陽性,橘紅色為弱陽性,黃色為陰性 意義:大腸、沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌、等為陽性;腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性,7 葡萄糖酸鹽試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌能氧化葡萄糖酸鹽作為唯一碳源,生成2-酮基葡萄糖酸鹽。加入班氏試劑,于沸水煮沸10分鐘,出現(xiàn)磚紅色沉淀,表明有葡萄糖酸鹽的存在 培養(yǎng)基:2-酮基葡萄糖酸鹽肉湯 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)18-24h,于其中加入0.3ml濃縮班氏試劑,然后沸水中煮沸10分鐘,出
6、現(xiàn)磚紅色沉淀表明有葡萄糖酸鹽的存在 意義:用于腸桿菌科分類,二 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn),1 明膠液化試驗(yàn) 原理:細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶,能使明膠分解為氨基酸,從而失去凝固力,半固體變?yōu)橐后w 方法:待測(cè)菌接種于明膠培養(yǎng)基,22 培養(yǎng)7天。若用35 孵育,因明膠在此溫度下自行液化,故在觀察前先置4 冰箱30min再觀察 結(jié)果:培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性 意義:多數(shù)假單胞菌能液化明膠,腸桿菌科細(xì)菌如:沙雷菌、變形桿菌、 陰溝桿菌等可液化明膠,2 吲哚(?;|(zhì))試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚,當(dāng)加入吲哚試劑-柯氏試劑(對(duì)二氨基苯甲醛)后則形成紅色的玫瑰吲哚 培養(yǎng)基:蛋白胨水
7、方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)24-48小時(shí),沿試管壁緩慢加入吲哚試劑 結(jié)果:于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽性,無色為陰性 意義:腸桿菌科細(xì)菌的鑒定;大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯為陽性 試劑:柯氏試劑(對(duì)二氨基苯甲醛)與歐氏試劑的區(qū)別:前者含戊醇,后者含酒精,都含濃鹽酸,前者主要成分為后者10倍,后者靈敏度更高,硫化氫試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸,產(chǎn)生硫化氫,后者遇亞鐵離子或鉛則形成黑褐色的沉淀。 培養(yǎng)基:醋酸鉛培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)24-48小時(shí)觀察結(jié)果 結(jié)果:培養(yǎng)基變黑為陽性,不變?yōu)殛幮?意義:沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌
8、屬、腐敗假單胞菌為陽性,4 尿素分解試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌具有尿素分解酶,能分解尿素產(chǎn)生大量的氨,使培養(yǎng)基呈堿性 培養(yǎng)基:尿素培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果 結(jié)果:培養(yǎng)基呈堿性,使酚紅指示劑變紅為陽性,不變?yōu)殛幮?意義:變形桿菌、摩根氏、雷氏普羅維登氏、克雷伯氏為陽性,5 苯丙氨酸脫氨酶(TDA)試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶,使苯丙氨酸脫去氨基形成苯丙酮酸,加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng) 培養(yǎng)基:苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)18-24小時(shí),加10%三氯化鐵試劑3-4滴,觀察結(jié)果 結(jié)果:腸桿菌科變形桿菌、普羅維登氏菌、摩根
9、氏菌陽性,6 氨基酸脫羧酶試驗(yàn),原理:具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌,能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳,使培養(yǎng)基變堿,使指示劑顯色 培養(yǎng)基:氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對(duì)照培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,并加入無菌液體石蠟,35 培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果 結(jié)果:對(duì)照管應(yīng)呈黃色,測(cè)定管呈紫色,(指示劑為溴甲酚紫)測(cè)定管呈黃色為陰性;若對(duì)照管呈紫色則試驗(yàn)無意義 意義:腸桿菌科細(xì)菌的鑒定,三 碳源和氮源利用試驗(yàn),枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 原理:某些細(xì)菌能以枸櫞酸鹽為唯一碳源,可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長,分解枸櫞酸鹽,使培養(yǎng)基變堿 培養(yǎng)基:枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時(shí),觀察結(jié)果
10、 結(jié)果:培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性,不變色為陰性 意義:克雷伯菌屬、沙門菌屬常為陽性,丙二酸鹽利用試驗(yàn),原理:有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽為唯一碳源,將其分解生成碳酸鈉,使培養(yǎng)基變堿 培養(yǎng)基:丙二酸鹽培養(yǎng)基 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時(shí),觀察結(jié)果 結(jié)果:培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)為陽性,無變化則為陰性 意義:腸桿菌科屬間鑒別,四 各種酶類試驗(yàn),1 氧化酶試驗(yàn) 原理:細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶,。具有氧化酶的細(xì)菌,首先使細(xì)胞色素C氧化,再由氧化型細(xì)胞色素C使對(duì)苯二胺氧化,生成有色的醌類化合物 試劑:1%鹽酸四甲基對(duì)苯二胺或1%鹽酸二甲基對(duì)苯二
11、胺 方法:菌落法、濾紙法、試劑紙片法。前二者浪費(fèi)試劑,后者節(jié)省 結(jié)果:10秒內(nèi)呈深紫紅色為陽性 應(yīng)用:腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的區(qū)別,前者陰性,后者多陽性 奈瑟菌屬、莫拉菌屬也為陽性,2 觸酶試驗(yàn),原理:具有過氧化氫酶的細(xì)菌,能催化過氧化氫生成水和氧,出現(xiàn)氣泡 試劑:3%過氧化氫溶液 方法:取菌置于潔凈的試管或玻片上,然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴,觀察結(jié)果 結(jié)果:出現(xiàn)大量氣泡的為陽性,不產(chǎn)生氣泡的為陰性 意義:用于革蘭氏陽性球菌的鑒別,葡萄球菌和微球菌為陽性,鏈球菌和腸球菌為陰性,腸球菌多假陽性,硝酸鹽還原試驗(yàn),原理:硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨,氨再轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物;硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧
12、作為呼吸系統(tǒng)中的終末受氫體。有的細(xì)菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,有的能使其還原為亞硝酸鹽和離子銨,有的能使其還原為氮 培養(yǎng)基:硝酸鹽培養(yǎng)基 試劑:甲(對(duì)氨基苯磺酸),乙(奈胺) 方法:待測(cè)菌接種于培養(yǎng)基,35 培養(yǎng)18-24小時(shí),將甲乙液分別加入培養(yǎng)基,立即觀察結(jié)果 結(jié)果:出現(xiàn)紅色為陽性 注意:若加入試劑后無反應(yīng),可能是硝酸鹽沒有被還原,試驗(yàn)陰性硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而致假陰性,此時(shí)要加入少許鋅粉,若出現(xiàn)紅色則為陰性,不產(chǎn)生紅色則為假陰性,實(shí)際為陽性 意義:腸桿菌科為陽性;銅綠、嗜麥芽能產(chǎn)生氮?dú)?;鏈球菌腸球菌陰性,葡萄球菌陽性,4 DNA酶試驗(yàn),原理:某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶,可使長鏈DNA
13、水解,后者可被酸沉淀,長鏈DNA水解后形成的寡核苷酸鏈則溶于酸,所以在平板上加入酸后會(huì)在菌落周圍形成透明環(huán) 培養(yǎng)基:0.2%DNA瓊脂平板 方法:點(diǎn)種被測(cè)菌于上述平板, 35 培養(yǎng)18-24小時(shí);用1mol/L鹽酸覆蓋平板,觀察結(jié)果 結(jié)果:菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性 意義:金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、變形桿菌陽性,凝固酶試驗(yàn),原理:致病性葡萄球菌;結(jié)合凝固酶、游離凝固酶;纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白使血漿凝固 方法:1 玻片法檢測(cè)結(jié)合凝固酶 兔血漿 2試管法檢測(cè)游離凝固酶 0.5ml兔血漿37 水浴3-4 結(jié)果:玻片法中有明顯顆粒樣凝集而鹽水對(duì)照無凝集為陽性 試管法以血漿凝固為陽性 意義:致病性葡萄球菌
14、;金黃色葡萄球菌多陽性,6 CAMP試驗(yàn),原理:B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子,可促進(jìn)葡萄球菌的溶血毒素的活性,在兩菌的交界處溶血力加強(qiáng),出現(xiàn)矢形溶血區(qū) 培養(yǎng)基;BAP 方法:先以產(chǎn)溶血毒素的金葡菌劃一橫線接種于BAP,再將被測(cè)菌與前一劃線作垂直劃線接種,兩線不能相交,0.5-1cm,37 培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察結(jié)果,設(shè)陰陽性對(duì)照 結(jié)果:在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣溶血區(qū)為陽性 意義:B群鏈球菌陽性,馬紅球菌出現(xiàn)反CAMP現(xiàn)象,膽汁溶菌酶試驗(yàn),原理:膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌,使細(xì)菌發(fā)生自溶 試劑:10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁 方法: 平板法:滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測(cè)菌落上35 30min觀察結(jié)
15、果 試管法:0.9ml被測(cè)菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35 水浴10-30min觀察結(jié)果 結(jié)果:菌落消失,或培養(yǎng)物變透明為陽性 意義:肺炎鏈球菌陽性,8 脂酶、卵磷脂酶、鹼性磷酸酶,主要用于厭氧菌的鑒定 產(chǎn)氣夾膜梭菌卵磷脂酶陽性 中間類桿菌脂酶陽性 致病性葡萄球菌鹼性磷酸酶陽性,如金葡等,五 抑菌試驗(yàn),1 O/129試驗(yàn) 原理: O/129(二氨基喋啶)對(duì)弧菌屬有抑制作用,而對(duì)氣單胞菌屬無抑制作用 培養(yǎng)基;堿性瓊脂培養(yǎng)基 方法:紙片法藥敏 40ug/片 結(jié)果:有抑菌環(huán)為敏感,無抑菌環(huán)為耐藥 意義:弧菌、鄰單胞菌敏感;氣單胞菌屬耐藥,桿菌肽試驗(yàn),原理:A群鏈球菌對(duì)桿菌肽幾乎全敏感,
16、而其他鏈球菌則耐藥 培養(yǎng)基:BAP 方法:同紙片法藥敏0.04U/片 結(jié)果:10mm敏感;10mm耐藥 意義:A群鏈球菌敏感,3 奧普托欣Optochin試驗(yàn),原理:肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感,其他鏈球菌無抑制作用 培養(yǎng)基:BAP 方法:同紙片法藥敏 5ug/片 結(jié)果:抑菌環(huán)直徑14mm敏感;14mm耐藥此時(shí)加做膽汁溶菌試驗(yàn)證實(shí) 意義:肺炎鏈球菌對(duì)Optochin敏感,4 新生霉素敏感試驗(yàn),原理:表皮葡萄球菌對(duì)新生霉素敏感;腐生葡萄球菌對(duì)新生霉素耐藥 培養(yǎng)基:MH瓊脂 方法:同紙片法藥敏 5ug/片 結(jié)果:抑菌環(huán)直徑16mm敏感;16mm耐藥 意義:區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌,氫氧化鉀拉絲試驗(yàn),(1)原理:革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁在稀堿溶液中易于破裂,釋放出未斷裂的DNA螺旋,使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性,可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來,而革蘭陽性細(xì)菌在稀堿溶液中沒有上述變化。 (2)方法:取1滴4
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