細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng).ppt

1、細(xì)菌鑒定之生化反應(yīng),南醫(yī)大三附院檢驗(yàn)科 江培濤,常用試驗(yàn),碳水化合物的代謝試驗(yàn) 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn) 碳源和氮源利用試驗(yàn) 各種酶類試驗(yàn) 抑菌試驗(yàn),一 碳水化合物的代謝試驗(yàn),1 糖（醇、苷）類發(fā)酵試驗(yàn) 原理：細(xì)菌含有發(fā)酵糖（醇、苷）的酶分解糖類產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、或僅產(chǎn)酸 培養(yǎng)基：含有0.5%1%的糖（醇、苷）的液體、半固體、固體、或 微量生化管 方法： 純菌種接種培養(yǎng)基，要求的溫度，數(shù)小時至兩周，微量管注意保持濕潤，以免干燥 結(jié)果：能分解糖（醇、苷）類產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基中的指示劑呈酸性反應(yīng) 若能產(chǎn)氣時，培養(yǎng)基可出現(xiàn)開裂氣泡等現(xiàn)象 意義：腸桿菌科尤為重要,2 氧化-發(fā)酵試驗(yàn)（O/F）,原理：細(xì)菌分解葡萄

2、糖的過程中，必須有分子氧參加的，稱為氧化型；可以進(jìn)行無氧降解的，稱為發(fā)酵型；不分解葡萄糖的稱為產(chǎn)堿型 培養(yǎng)基：HL二氏培養(yǎng)基 方法；待測菌同時接種兩只HL培養(yǎng)基，其中一只滴加無菌的液體石蠟，高度不少于1cm，35培養(yǎng)48h或更長 結(jié)果：兩只均無變化為產(chǎn)堿型；兩只均產(chǎn)酸為發(fā)酵型；僅不加石蠟的產(chǎn)酸為氧化型 意義：腸桿菌科與非發(fā)酵菌的鑒別；葡萄球菌與微球菌的鑒別，前者為發(fā)酵型，后者為氧化型,3 ONPG（半乳糖苷酶試驗(yàn)）,原理：有的細(xì)菌可以產(chǎn)生半乳糖苷酶，分解鄰-硝基酚- 半乳糖苷生成黃色的鄰-硝基酚 方法：從KIA上取菌，于0.25ML無菌生理鹽水中制菌懸液，加甲苯一滴，使酶釋放。37 水浴5mi

3、n,加0.25mlONPG試劑，水浴20min-3h觀察結(jié)果 結(jié)果：呈現(xiàn)黃色為陽性，一般20-30min內(nèi)顯色 意義：迅速及遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陽性，不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌為陰性。本試驗(yàn)主要用于遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌的快速鑒定 注意：該試驗(yàn)不一定與分解乳糖相一致，決定于細(xì)菌產(chǎn)生的酶及其活性,七葉苷水解試驗(yàn),原理：有的細(xì)菌可將七葉苷分解成葡萄糖和七葉素，后者與培養(yǎng)基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應(yīng)生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色 方法：將待測菌接種于七葉苷培養(yǎng)基，培養(yǎng)后觀察結(jié)果 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮?意義：D群鏈球菌與其他鏈球菌的區(qū)別，前者為陽性；肺炎克雷伯、陰溝腸桿菌多陽性,V-P試驗(yàn),原理：細(xì)

4、菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者脫羧產(chǎn)生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，進(jìn)而與培養(yǎng)基中蛋白胨內(nèi)精氨酸中的胍基作用，生成紅色化合物，即為V-P試驗(yàn)陽性。奈酚可加速此反應(yīng) 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 48h，加入甲液（6%奈酚酒精溶液）和乙液（40 %KOH溶液） 結(jié)果：20min內(nèi)出現(xiàn)紅色為陽性，如無紅色，且于35 4h 后仍如故即為陰性 意義：本試驗(yàn)常與甲基紅一起試驗(yàn)，前者陽性則后者多陰性,甲基紅試驗(yàn),原理：細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，后者進(jìn)一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培養(yǎng)基的PH降至4.5以下，加入甲基紅試劑后顯紅色即陽性。若產(chǎn)酸量少，或進(jìn)一步轉(zhuǎn)

5、化為其他物質(zhì)，則培養(yǎng)基的PH仍在6.2以上，加入甲基紅試劑后顯黃色，為陰性 培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白胨水 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，2-4天后，加入甲基紅試劑，觀察結(jié)果 結(jié)果：呈現(xiàn)紅色為陽性，橘紅色為弱陽性，黃色為陰性 意義：大腸、沙門、志賀、變形、枸櫞酸桿菌、等為陽性；腸桿菌屬、哈夫尼亞菌屬為陰性,7 葡萄糖酸鹽試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌能氧化葡萄糖酸鹽作為唯一碳源，生成2-酮基葡萄糖酸鹽。加入班氏試劑，于沸水煮沸10分鐘，出現(xiàn)磚紅色沉淀，表明有葡萄糖酸鹽的存在 培養(yǎng)基：2-酮基葡萄糖酸鹽肉湯 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24h，于其中加入0.3ml濃縮班氏試劑，然后沸水中煮沸10分鐘，出

6、現(xiàn)磚紅色沉淀表明有葡萄糖酸鹽的存在 意義：用于腸桿菌科分類,二 蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗(yàn),1 明膠液化試驗(yàn) 原理：細(xì)菌產(chǎn)生明膠酶，能使明膠分解為氨基酸，從而失去凝固力，半固體變?yōu)橐后w 方法：待測菌接種于明膠培養(yǎng)基，22 培養(yǎng)7天。若用35 孵育，因明膠在此溫度下自行液化，故在觀察前先置4 冰箱30min再觀察 結(jié)果：培養(yǎng)基呈液化狀態(tài)為陽性 意義：多數(shù)假單胞菌能液化明膠，腸桿菌科細(xì)菌如：沙雷菌、變形桿菌、 陰溝桿菌等可液化明膠,2 吲哚（?；|(zhì)）試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸產(chǎn)生吲哚，當(dāng)加入吲哚試劑-柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）后則形成紅色的玫瑰吲哚 培養(yǎng)基：蛋白胨水

7、方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)24-48小時，沿試管壁緩慢加入吲哚試劑 結(jié)果：于兩者接觸面出現(xiàn)紅色為陽性，無色為陰性 意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定；大腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯為陽性 試劑：柯氏試劑（對二氨基苯甲醛）與歐氏試劑的區(qū)別：前者含戊醇，后者含酒精，都含濃鹽酸，前者主要成分為后者10倍，后者靈敏度更高,硫化氫試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸，產(chǎn)生硫化氫，后者遇亞鐵離子或鉛則形成黑褐色的沉淀。 培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于醋酸鉛培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)24-48小時觀察結(jié)果 結(jié)果：培養(yǎng)基變黑為陽性，不變?yōu)殛幮?意義：沙門菌屬、愛德華菌屬、亞利桑那菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌

8、屬、腐敗假單胞菌為陽性,4 尿素分解試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性 培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果 結(jié)果：培養(yǎng)基呈堿性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變?yōu)殛幮?意義：變形桿菌、摩根氏、雷氏普羅維登氏、克雷伯氏為陽性,5 苯丙氨酸脫氨酶（TDA）試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌可產(chǎn)生苯丙氨酸脫氨酶，使苯丙氨酸脫去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化鐵試劑后產(chǎn)生綠色反應(yīng) 培養(yǎng)基：苯丙氨酸瓊脂培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時，加10%三氯化鐵試劑3-4滴，觀察結(jié)果 結(jié)果：腸桿菌科變形桿菌、普羅維登氏菌、摩根

9、氏菌陽性,6 氨基酸脫羧酶試驗(yàn),原理：具有氨基酸脫羧酶的細(xì)菌，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳，使培養(yǎng)基變堿，使指示劑顯色 培養(yǎng)基：氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基和氨基酸對照培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，并加入無菌液體石蠟，35 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果 結(jié)果：對照管應(yīng)呈黃色，測定管呈紫色，（指示劑為溴甲酚紫）測定管呈黃色為陰性；若對照管呈紫色則試驗(yàn)無意義 意義：腸桿菌科細(xì)菌的鑒定,三 碳源和氮源利用試驗(yàn),枸櫞酸鹽利用試驗(yàn) 原理：某些細(xì)菌能以枸櫞酸鹽為唯一碳源，可在枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上生長，分解枸櫞酸鹽，使培養(yǎng)基變堿 培養(yǎng)基：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果

10、 結(jié)果：培養(yǎng)基中的溴麝香草酚蘭指示劑由淡綠色變?yōu)樯钏{(lán)色為陽性，不變色為陰性 意義：克雷伯菌屬、沙門菌屬常為陽性,丙二酸鹽利用試驗(yàn),原理：有的細(xì)菌可利用丙二酸鹽為唯一碳源，將其分解生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變堿 培養(yǎng)基：丙二酸鹽培養(yǎng)基 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基35 培養(yǎng)18-24小時，觀察結(jié)果 結(jié)果：培養(yǎng)基由淡綠變?yōu)樯钏{(lán)為陽性，無變化則為陰性 意義：腸桿菌科屬間鑒別,四 各種酶類試驗(yàn),1 氧化酶試驗(yàn) 原理：細(xì)胞色素氧化酶是細(xì)胞色素呼吸酶系統(tǒng)的最終呼吸酶，。具有氧化酶的細(xì)菌，首先使細(xì)胞色素C氧化，再由氧化型細(xì)胞色素C使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物 試劑：1%鹽酸四甲基對苯二胺或1%鹽酸二甲基對苯二

11、胺 方法：菌落法、濾紙法、試劑紙片法。前二者浪費(fèi)試劑，后者節(jié)省 結(jié)果：10秒內(nèi)呈深紫紅色為陽性 應(yīng)用：腸桿菌科細(xì)菌與假單胞菌的區(qū)別，前者陰性，后者多陽性 奈瑟菌屬、莫拉菌屬也為陽性,2 觸酶試驗(yàn),原理：具有過氧化氫酶的細(xì)菌，能催化過氧化氫生成水和氧，出現(xiàn)氣泡 試劑：3%過氧化氫溶液 方法：取菌置于潔凈的試管或玻片上，然后滴加3%過氧化氫數(shù)滴，觀察結(jié)果 結(jié)果：出現(xiàn)大量氣泡的為陽性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性 意義：用于革蘭氏陽性球菌的鑒別，葡萄球菌和微球菌為陽性，鏈球菌和腸球菌為陰性，腸球菌多假陽性,硝酸鹽還原試驗(yàn),原理：硝酸鹽還原成亞硝酸鹽和氨，氨再轉(zhuǎn)化為氨基酸和其他含氮化合物；硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧

12、作為呼吸系統(tǒng)中的終末受氫體。有的細(xì)菌能使硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，有的能使其還原為亞硝酸鹽和離子銨，有的能使其還原為氮 培養(yǎng)基：硝酸鹽培養(yǎng)基 試劑：甲（對氨基苯磺酸），乙（奈胺） 方法：待測菌接種于培養(yǎng)基，35 培養(yǎng)18-24小時，將甲乙液分別加入培養(yǎng)基，立即觀察結(jié)果 結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽性 注意：若加入試劑后無反應(yīng)，可能是硝酸鹽沒有被還原，試驗(yàn)陰性硝酸鹽被還原為氨和氮等其他產(chǎn)物而致假陰性，此時要加入少許鋅粉，若出現(xiàn)紅色則為陰性，不產(chǎn)生紅色則為假陰性，實(shí)際為陽性 意義：腸桿菌科為陽性；銅綠、嗜麥芽能產(chǎn)生氮?dú)?；鏈球菌腸球菌陰性，葡萄球菌陽性,4 DNA酶試驗(yàn),原理：某些細(xì)菌產(chǎn)生DNA酶，可使長鏈DNA

13、水解，后者可被酸沉淀，長鏈DNA水解后形成的寡核苷酸鏈則溶于酸，所以在平板上加入酸后會在菌落周圍形成透明環(huán) 培養(yǎng)基：0.2%DNA瓊脂平板 方法：點(diǎn)種被測菌于上述平板， 35 培養(yǎng)18-24小時；用1mol/L鹽酸覆蓋平板，觀察結(jié)果 結(jié)果：菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)為陽性 意義：金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌、變形桿菌陽性,凝固酶試驗(yàn),原理：致病性葡萄球菌；結(jié)合凝固酶、游離凝固酶；纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白使血漿凝固 方法：1 玻片法檢測結(jié)合凝固酶 兔血漿 2試管法檢測游離凝固酶 0.5ml兔血漿37 水浴3-4 結(jié)果：玻片法中有明顯顆粒樣凝集而鹽水對照無凝集為陽性 試管法以血漿凝固為陽性 意義：致病性葡萄球菌

14、；金黃色葡萄球菌多陽性,6 CAMP試驗(yàn),原理：B群鏈球菌能產(chǎn)生CAMP因子，可促進(jìn)葡萄球菌的溶血毒素的活性，在兩菌的交界處溶血力加強(qiáng)，出現(xiàn)矢形溶血區(qū) 培養(yǎng)基；BAP 方法：先以產(chǎn)溶血毒素的金葡菌劃一橫線接種于BAP，再將被測菌與前一劃線作垂直劃線接種，兩線不能相交，0.5-1cm，37 培養(yǎng)18-24小時觀察結(jié)果，設(shè)陰陽性對照 結(jié)果：在兩劃線交界處出現(xiàn)箭頭樣溶血區(qū)為陽性 意義：B群鏈球菌陽性，馬紅球菌出現(xiàn)反CAMP現(xiàn)象,膽汁溶菌酶試驗(yàn),原理：膽汁或膽鹽可溶解肺炎鏈球菌，使細(xì)菌發(fā)生自溶 試劑：10%去氧膽酸鈉或純牛膽汁 方法： 平板法：滴加10%去氧膽酸鈉一環(huán)于被測菌落上35 30min觀察結(jié)

15、果 試管法：0.9ml被測菌培養(yǎng)物加入10%去氧膽酸鈉0.1ml后置35 水浴10-30min觀察結(jié)果 結(jié)果：菌落消失，或培養(yǎng)物變透明為陽性 意義：肺炎鏈球菌陽性,8 脂酶、卵磷脂酶、鹼性磷酸酶,主要用于厭氧菌的鑒定 產(chǎn)氣夾膜梭菌卵磷脂酶陽性 中間類桿菌脂酶陽性 致病性葡萄球菌鹼性磷酸酶陽性，如金葡等,五 抑菌試驗(yàn),1 O/129試驗(yàn) 原理： O/129（二氨基喋啶）對弧菌屬有抑制作用，而對氣單胞菌屬無抑制作用 培養(yǎng)基；堿性瓊脂培養(yǎng)基 方法：紙片法藥敏 40ug/片 結(jié)果：有抑菌環(huán)為敏感，無抑菌環(huán)為耐藥 意義：弧菌、鄰單胞菌敏感；氣單胞菌屬耐藥,桿菌肽試驗(yàn),原理：A群鏈球菌對桿菌肽幾乎全敏感，

16、而其他鏈球菌則耐藥 培養(yǎng)基：BAP 方法：同紙片法藥敏0.04U/片 結(jié)果：10mm敏感；10mm耐藥 意義：A群鏈球菌敏感,3 奧普托欣Optochin試驗(yàn),原理：肺炎鏈球菌對Optochin敏感，其他鏈球菌無抑制作用 培養(yǎng)基：BAP 方法：同紙片法藥敏 5ug/片 結(jié)果：抑菌環(huán)直徑14mm敏感；14mm耐藥此時加做膽汁溶菌試驗(yàn)證實(shí) 意義：肺炎鏈球菌對Optochin敏感,4 新生霉素敏感試驗(yàn),原理：表皮葡萄球菌對新生霉素敏感；腐生葡萄球菌對新生霉素耐藥 培養(yǎng)基：MH瓊脂 方法：同紙片法藥敏 5ug/片 結(jié)果：抑菌環(huán)直徑16mm敏感；16mm耐藥 意義：區(qū)別表皮葡萄球菌與腐生葡萄球菌,氫氧化鉀拉絲試驗(yàn),(1)原理：革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁在稀堿溶液中易于破裂，釋放出未斷裂的DNA螺旋，使氫氧化鉀菌懸液呈現(xiàn)粘性，可用接種環(huán)攪拌后拉出粘絲來，而革蘭陽性細(xì)菌在稀堿溶液中沒有上述變化。 (2)方法：取1滴4