實驗五 金黃色葡萄球菌檢測概述.ppt

1、實驗五 乳制品中金黃色葡萄球菌檢測,生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,革蘭氏陽性球菌，直徑為0.8-1.0微米，鏡檢時呈單個、成對、四聯(lián)或不規(guī)則的簇群； 無芽孢，不運動； 兼性厭氧菌，在好氧條件下生長最好； 可在15%氯化鈉和40%膽汁中生長,生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,大多數(shù)菌株能生長在6.5-46之間（最適溫度30-37）能在pH4.2-9.3之間生長（最適pH為7.0-7.5）； 大多數(shù)菌株產(chǎn)生類胡羅卜素，使細胞團呈現(xiàn)出深橙色到淺黃色，色素的產(chǎn)生取決于生長的條件，而且在單個菌株中可能也有變化,生物學(xué)特性-菌體形態(tài)及培養(yǎng)特征,好氧生長的細胞產(chǎn)生接觸酶； 產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和

2、溶菌酶，大多數(shù)菌株可水解天然的動物蛋白，例如血紅蛋白、纖維蛋白、卵白、酪朊和多肽類如明膠，水解脂類、吐溫類和磷脂蛋白質(zhì)，并釋放脂肪酸； 所有的毒株產(chǎn)生凝固酶，人和動物來源的菌株通?？赡掏?、人、馬和豬的血漿。,致病性,金黃色葡萄球菌為條件致病菌，菌株致病力的強弱主要取決于其產(chǎn)生的毒素和侵襲性酶： a.溶血素：外毒素，分、四種，能損傷血小板，破壞溶酶體，引起肌體局部缺血和壞死； b.殺白細胞素：可破壞人的白細胞和巨噬細胞； c.血漿凝固酶：當(dāng)金黃色葡萄球菌侵入人體時，該酶使血液或血漿中的纖維蛋白沉積于菌體表面或凝固，阻礙吞噬細胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化與此酶有關(guān)； d.脫氧核糖核酸

3、酶：金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶能耐受高溫，可用來作為依據(jù)鑒定金黃色葡萄球菌； e.腸毒素：金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生數(shù)種引起急性胃腸炎的蛋白質(zhì)性腸毒素，分為A、B、C、D、E五種。,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌腸毒素所引起的疾病，可引發(fā)不同程度的急性胃腸炎癥狀，惡心、嘔吐最為突出而且普遍，腹痛、腹瀉次之。 當(dāng)金黃色葡萄球菌污染了含淀粉及水分較多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在溫度條件適宜時，經(jīng)8-10小時即可相當(dāng)數(shù)量的腸毒素。,分布,在自然界中廣泛存在，空氣、水、灰塵及人和動物的排泄物中都可找到。 作為人和動物的常見病原菌，其主要存在于人和動物的鼻腔、咽喉、頭發(fā)上，50%以上健康

4、人的皮膚上都有金黃色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的機會很多。 傳播媒介為被該菌污染的食品，主要為淀粉類(如剩飯、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及魚、肉、蛋類等。被污染的食物在室溫20-22放置5小時以上時，病菌大量繁殖，并產(chǎn)生腸毒素。,流行病學(xué),季節(jié)分布，多見于春夏季； 中毒食品種類多，如奶、肉、蛋、魚及其制品。此外，剩飯、油煎蛋、糯米糕及涼粉等引起的中毒事件也有報道。上呼吸道感染患者鼻腔帶菌率83%，所以人畜化膿性感染部位常成為污染源。,流行病學(xué),金黃色葡萄球菌腸毒素是個世界性衛(wèi)生問題，在美國由金黃色葡萄球菌腸毒素引起的食物中毒占整個細菌性食物中毒的33%，加拿大則更多，占45%，我國每

5、年發(fā)生的此類中毒事件也非常多。,流行病學(xué),腸毒素形成條件： 存放溫度，在37C內(nèi)，溫度越高，產(chǎn)毒時間越短； 存放地點，通風(fēng)不良氧分壓低易形成腸毒素； 食物種類，含蛋白質(zhì)豐富，水分多，同時含一定量淀粉的食物，腸毒素易生成。,耐受力,幾乎所有的消毒試劑以及熱加工過程對金黃色葡萄球菌都有嚴(yán)重的破壞作用 腸毒素可耐受100 30分鐘不被破壞。 對于加工過的食品或食品加工設(shè)備而言，此菌或其腸毒素的存在通常作為衛(wèi)生條件差的一種指標(biāo)。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 防止帶菌人群對各種食物的污染：定期對生產(chǎn)加工人員進行健康檢查，患局部化膿性感染（如疥瘡、手指化膿等）、上呼吸道感染（如鼻竇炎、化膿性肺

6、炎、口腔疾病等）的人員要暫時停止其工作或調(diào)換崗位。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 防止金黃色葡萄球菌對奶及其制品的污染：如牛奶廠要定期檢查奶牛的乳房，不能擠用患化膿性乳腺炎的牛奶；奶擠出后，要迅速冷至-10以下，以防毒素生成、細菌繁殖。奶制品要以消毒牛奶為原料，注意低溫保存。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌污染食品 對肉制品加工廠，患局部化膿感染的禽、畜尸體應(yīng)除去病變部位，經(jīng)高溫或其他適當(dāng)方式處理后進行加工生產(chǎn)。,污染的控制,防止金黃色葡萄球菌腸毒素的生成 應(yīng)在低溫和通風(fēng)良好的條件下貯藏食物，以防腸毒素形成； 在氣溫高的春夏季，食物置冷藏或通風(fēng)陰涼地方也不應(yīng)超過6小時，并且食用前要徹

7、底加熱。,檢測步驟-增菌,利用金黃色葡萄球菌耐鹽的特性（可耐受15%的氯化鈉），用含10%氯化鈉的胰酪胨大豆肉湯增菌。,檢測步驟-分離,血平板：金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生溶血素，因此在血平板上產(chǎn)生明顯的溶血環(huán)。 血平板上其典型菌落呈金黃色，有時也為白色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，有溶血圈。,檢測步驟-分離,BP平板： 胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏提供碳源、氮源、硫、維生素和痕量礦物元素 丙酮酸鈉是一種生長促進劑 亞碲酸鹽對除金黃色葡萄球外的其他能分解卵黃的菌株有毒性，并使菌落產(chǎn)生黑色 卵黃提供營養(yǎng)和有利于觀察卵磷脂環(huán) 甘氨酸和氯化鋰對金黃色葡萄球菌以外的其它菌株有抑制作用。,檢測步驟-分離,在

8、BP平板上其典型菌落為：圓形，光滑突起，濕潤，直徑2-3mm，顏色呈灰色到黑玉色，邊緣常為淡色（米黃色或灰白色略帶灰色或黃色的白色），周圍為一混濁帶，在其外緣常有一透明圈。用接種針接觸菌落似有黃油樹膠的粘稠感。 偶然會遇到不分解脂肪菌株，除無混濁帶及透明圈外，其他外觀基本相同。 長期保存的冷凍或干燥食品中所分離的菌落，其黑色常較典型菌落淡些，且外觀可能粗燥，質(zhì)地較干燥。,檢測步驟-鑒定,金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生凝固酶，因此對其鑒別的主要實驗是測定其凝固酶。 對于凝固不完全的菌株，可以通過一些其他實驗來進一步確認(rèn)，例如：厭氧葡萄糖發(fā)酵、溶葡萄球菌酶敏感性實驗、耐熱核酸酶實驗等。 所有這些實驗不能作

9、為鑒別其產(chǎn)毒與否的依據(jù)。,一、實驗?zāi)康囊?了解食品的質(zhì)量與金黃色葡萄球菌檢驗的意義。 掌握金黃色葡萄球菌的生物學(xué)特性。 掌握金黃色葡萄球菌檢驗的生化試驗的操作方法和結(jié)果的判斷。 掌握食品中金黃色葡萄球菌檢驗的方法和技術(shù)。,二、原理 葡萄球菌在自然界分布極廣，空氣、土壤、水、飼料、食品(剩飯、糕點、牛奶、肉品等)以及人和動物的體表粘膜等處均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黃色葡萄球菌是葡萄球菌屬一個種?？梢鹌つw組織炎癥，還能產(chǎn)生腸毒素。如果在食品中大量生長繁殖，產(chǎn)生毒素，人誤食了含有毒素的食品，就會發(fā)生食物中毒，故食品中存在金黃色葡萄球菌對人的健康是一種潛在危險，檢查食品中金黃

10、色葡萄球菌及數(shù)量具有實際意義。 金黃色葡萄球菌能產(chǎn)生凝固酶，使血漿凝固，多數(shù)致病菌株能產(chǎn)生溶血毒素，使血瓊脂平板菌落周圍出現(xiàn)溶血環(huán)，在試管中出現(xiàn)溶血反應(yīng)。這些是鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)。,三、試劑和儀器 （一）最先準(zhǔn)備的器材 規(guī)格名稱數(shù)量用途 1、500ml三角瓶1個7.5%氯化鈉肉湯 2、500ml三角瓶1個10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 3、250ml三角瓶4個制血培養(yǎng)基等 4、10100mm試管6支血漿凝固酶試驗 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管2 支 7、直徑為90mm平皿 12套 制血平板、B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）應(yīng)滅菌的其它器材 剪刀1把不銹鋼湯匙1

11、把 稱量紙適量,（三）應(yīng)制備的培養(yǎng)基 培養(yǎng)基總量所用容器 7.5%氯化鈉肉湯 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯 225ml/瓶1瓶 500ml三角瓶 血瓊脂 100ml/瓶1瓶 250ml三角瓶 BP培養(yǎng)基 95ml/瓶1瓶 250ml三角瓶 兔血液 5ml,A.1 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯,A.1.1 成分 胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g 植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g 氯化鈉 100.0 g 磷酸氫二鉀 2.5 g 丙酮酸鈉 10.0 g 葡萄糖 2.5 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.30.2 A.1.2 制法 將上述成分混合，加熱，

12、輕輕攪拌并溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，每瓶 225 mL，121 高壓滅菌 15 min。,A.2 7.5%氯化鈉肉湯,A.2.1 成分 蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 氯化鈉 75 g 蒸餾水 1 000 mL pH 7.4 A.2.2 制法 將上述成分加熱溶解，調(diào)節(jié) pH，分裝，每瓶 225 mL，121 高壓滅菌 15 min。,A.3 血瓊脂平板,A.3.1 成分：豆粉瓊脂（pH7.47.6） 100 mL 脫纖維羊血（或兔血） 5 mL10 mL A.3.2 制法：加熱溶化瓊脂，冷卻至 50 ，以無菌操作加入脫纖維羊血，搖勻，傾注平板。 血瓊脂平板：蛋白胨10g 牛肉膏5g 氯

13、化鈉5g 瓊脂1020g 蒸餾水1000ml 煮沸至充分溶解，高壓滅菌1520min 待冷卻至50 左右時加入50ml抗凝羊血（除去纖維）或兔血。搖勻或攪勻倒平板或試管斜面。 溫度過高，培養(yǎng)基呈棕褐色；溫度過低則不利于血液與培養(yǎng)基混勻。,A.4 BairdParker瓊脂平板,A.4.1 成分 胰蛋白胨 10.0 g 牛肉膏 5.0 g 酵母膏 1.0 g 丙酮酸鈉 10.0 g 甘氨酸 12.0 g 氯化鋰（LiCl6H2O） 5.0 g 瓊脂 20.0 g 蒸餾水 950 mL pH 7.00.2 A.4.2 增菌劑的配法 30%卵黃鹽水 50 mL 與經(jīng)過除菌過濾的 1%亞碲酸鉀溶液 1

14、0 mL 混合，保存于冰箱內(nèi)。 A.4.3 制法 將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié) pH。分裝每瓶 95 mL，121 高壓滅菌 15 min。 臨用時加熱溶化瓊脂，冷至 50 ，每 95 mL 加入預(yù)熱至 50 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5 mL 搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過 48 h。 稱取本品63 克,加入950ml蒸餾水中,加熱煮沸溶解，分裝,121高壓滅菌15分鐘備用。冷至50，每95ml加入預(yù)熱至50的卵黃亞碲酸鉀增菌液(04-025)配套試劑（用法與用量見配套試劑說明）。搖勻后傾注平皿。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱儲存不得超過

15、48h）,四、實驗內(nèi)容 （一）、增菌培養(yǎng)法 樣品處理選擇性增菌選擇性平板分離血漿凝固酶試驗鑒別結(jié)果報告,第一天 樣品處理和增菌培養(yǎng) （一）、樣品處理 固體或半固體食品：以無菌操作稱取25g樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌均 質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)12min，制成1:10樣品勻液。 液體食品:：用滅菌吸管吸取25mL樣品，放入裝有225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內(nèi) (瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠)，經(jīng)充分振搖制成1:10樣品勻液。 （二）、增菌培養(yǎng) 接種操作：吸取5mL稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中。37C培養(yǎng)24小時。 培養(yǎng)：放于361培養(yǎng)24h。 培養(yǎng)結(jié)果：

16、在NaCl肉湯中呈混濁生長，胰蛋白胨肉湯中有時液體澄清，菌量多時呈混濁生長。,第二天 接種選擇性平板進行分離培養(yǎng) （一）、接種選擇性平板 取增菌液1環(huán)，劃線接種于血平板或BP平板。 （二）、培養(yǎng) 放于361培養(yǎng)24h。,第三天 觀察分離結(jié)果、鏡檢、做血漿凝固酶試驗 （一）、觀察分離結(jié)果 結(jié)果：金黃色葡萄球菌，在血平板上呈：金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈；在Baird-Parker平板上：菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶，在其外層有一透明圈。 （二）、革蘭氏染色、鏡檢 操作：革蘭氏染色鏡檢 結(jié)果：金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞，直

17、徑0.5-1m。 （三）、結(jié)果報告： 綜合形態(tài)特征，血平板情況以及血漿凝固酶試驗結(jié)果，判別檢樣有否金黃色葡萄球菌作出報告。,金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗,取肉湯培養(yǎng)物0.5mL同0.5mL凝固酶試驗兔血漿于試管內(nèi)充分混合,置 361培養(yǎng),定時觀察是否有凝塊形成,至少觀察6 h,以內(nèi)容物完全凝固,使試管倒置或 傾斜時不流動者為陽性。,1支加入金黃色葡萄球菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液0.5ml作陽性對照， 另1支加入營養(yǎng)肉湯或0.9無菌氯化鈉溶液0.5ml作陰性對照。,陽性和陰性對照,血漿凝固酶試驗 (1)取潔凈玻片一張，于兩端各加兔血漿一滴。 (2)用接種環(huán)取金黃色葡萄球菌苔一環(huán)，在玻片一端兔血漿

18、中研磨混勻，接種環(huán)滅 菌后再取白色葡萄球菌苔一環(huán)，在另一端兔血漿中研磨均勻。 (3)觀察兔血漿有無凝集現(xiàn)象。,四.檢驗和控制1金黃色葡萄球菌的檢驗樣品處理：無菌取25g或25mL食品樣品，放入225mL滅菌生理鹽水中均質(zhì)，制成10-1稀釋液。增菌培養(yǎng)：將10-1稀釋液接入7.5%NaCl肉湯或胰蛋白胨肉湯中，37C培養(yǎng)24小時。分離培養(yǎng)：將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37C培養(yǎng)24-48小時。金黃色葡萄球菌在血平板上呈金黃或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落為圓形，直徑2-3mm，顏色灰或黑色，周圍有一渾濁帶。,染色觀察：從平板上挑取可疑性菌落進行革蘭氏染色，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，顯微鏡下呈葡萄狀排列無芽胞、莢膜，直徑0.5-1m。血漿凝固酶試驗：吸取0.5mL兔血漿與0.5mL金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯24小時培養(yǎng)物充分混勻，置361C培養(yǎng)，每隔半小時觀察一次，連續(xù)觀察6小時，出現(xiàn)凝固，即將小試管傾斜或倒置時，內(nèi)容物不流動，判為陽性。同時做陰陽性對照。耐熱核酸酶試驗：將24小時肉湯培養(yǎng)物沸水浴處理15min，用接種環(huán)劃線刺種