簡(jiǎn)明微生物工程 3-2發(fā)酵機(jī)制-酒精、檸檬酸.ppt

1、三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的原理,TCA 與蛋白質(zhì)之間主要有以下幾個(gè)方面的作用： 在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽； 作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán), 使之聚集沉淀； 隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與致密性越大，TCA 可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去，在電泳前樣品加熱處理時(shí)可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生酸水解而形成碎片，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)這一作用愈加明顯； 電泳圖譜顯示，人血清蛋白 、牛血清蛋白 單體譜帶有較明顯的展寬現(xiàn)象，這可能是由于TCA 的結(jié)合，使SDS 與蛋白質(zhì)的結(jié)合量產(chǎn)生偏差，從而造成蛋白質(zhì)所帶電荷的不均一性，造成遷移率的不一致。,微生物的發(fā)酵機(jī)制,本章

2、重點(diǎn)： 1、酒精、乳酸、甘油的 發(fā)酵機(jī)制 2、檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制 3、谷氨酸的發(fā)酵機(jī)制,EMP途徑,HMP途徑,ED途徑,TCA循環(huán),第一節(jié) 糖代謝產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制,一、糖酵解途徑及調(diào)節(jié),葡萄糖 抑制 激活 己糖激酶 ADP AMP 葡萄糖-磷酸 果糖-磷酸 磷酸果糖激酶 ATP ADP AMP 果糖-，二磷酸 3-磷酸甘油醛二羥丙酮磷酸 3-磷酸甘油酸 2-磷酸甘油酸 葡萄糖-磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸 果糖-,二磷酸 丙酮酸激酶 ATP 3-磷酸甘油醛 丙酮酸,葡萄糖分解途徑,胞質(zhì) 線粒體 TCA循環(huán) 葡萄糖丙酮酸乙酰CoACO2+H2O 乙醇 乳酸,丙酮酸的去路,O2線粒體 乙酰CoATCACO

3、2+H2O NADH NAD+ 丙酮酸 乳酸 丙酮酸脫羧酶 NADH NAD+ 乙醛 乙醇 羧化酶 乙酰CoA,丙 酮 酸,乙醛,乙醇,CO2,H,H,乳酸,草酰乙酸,H,ATP,琥珀酸,丙酸,CO2,CO2,甲酸,(6),(5),(4),(3),(2),(1),H2,CO2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙醇,H,乙酰乳酸,CO2,3-羥基丁酮,H,2,3-丁二醇,CO2,H2,乙酰CoA,ATP,乙酸,乙酰乙酰CoA,CO2,ATP,ATP,H,H,丙酮,2-丙醇,丁酸,丁醇,H,二.乙醇生成機(jī)制,脫羧酶 NADH NAD+ 葡萄糖丙酮酸 乙醛 乙醇 1mol葡萄糖按100%生成2mol乙醇，

4、重量理論轉(zhuǎn)化率： 2*46.05/180.1 *100% =51.1 % 實(shí)際只有95%生成乙醇，5%構(gòu)成細(xì)胞或副產(chǎn)物，因此乙醇對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率約為48.5 % 副產(chǎn)物：雜醇油、琥珀酸、酯類(lèi)、糠醛、甲醇等,三、甘油的合成機(jī)制,1、正常情況，無(wú)氧生成乙醇 2、加入抑制劑（NaHSO3),形成甘油二型發(fā)酵 3、抑制劑不可太多，否則中毒，因此仍有乙醇 4、堿性（ pH7.6 ）條件下，乙醛歧化，產(chǎn)生甘油、乙醇、乙酸、CO2 酵母的三型發(fā)酵,四、乳酸發(fā)酵機(jī)制,1、同型乳酸發(fā)酵：產(chǎn)物只有乳酸 NADH NAD+ 葡萄糖=丙酮酸 =乳酸 1mol葡萄糖按100%生成2mol乳酸，乳酸對(duì)糖的理論轉(zhuǎn)化率： 2*9

5、0/180 *100% =100 % 進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的M：保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌,2、異型乳酸發(fā)酵通過(guò) HMP途徑的發(fā)酵,*概念 葡萄糖發(fā)酵除產(chǎn)生乳酸外還有 CO2 、乙醇或乙酸。,i ) 異 型 乳 酸 發(fā) 酵 經(jīng) 典 途 徑 轉(zhuǎn)化率50,腸膜明串珠菌屬 利用葡萄糖的反應(yīng),短乳桿菌利用核糖的反應(yīng),ii ) 雙 歧 桿 菌 途 徑 50,凈5個(gè),同型、異型乳酸發(fā)酵比較,100,50,五、檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制,為什么黑曲霉 能夠過(guò)量積累 檸檬酸？ 2 丙酮酸脫氫酶 3檸檬酸合成酶 4 烏頭酸水合酶 5 異檸檬酸脫氫酶 6 酮戊二酸脫 氫酶,（一）、檸檬酸積累

6、的機(jī)制：,1 由于錳離子缺乏抑制了蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NH4濃度升高和形成一條呼吸活力強(qiáng)的不產(chǎn)生ATP的側(cè)系呼吸鏈，這兩方面的原因分別解除了對(duì)PFK的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)了EMP途徑的暢通。 2、由于丙酮酸羧化酶組成型，不被調(diào)節(jié)控制，就源源不斷地提供草酰乙酸。原料充足,黑曲酶的標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈和側(cè)系呼吸鏈,NADH2 琥珀酸,黃素蛋白,Y,X,O2,側(cè)系呼吸鏈,細(xì)胞色素b,細(xì)胞色素c,細(xì)胞色素a、a3,水楊酰異羥 肟 酸,抑菌素抑制,EMP途徑的磷酸果糖激酶是一種調(diào)節(jié)酶。 在正常生理濃度范圍的檸檬酸和ATP對(duì)酶有抑制作用，AMP、無(wú)機(jī)磷和NH4對(duì)酶有活化作用， NH4還能有效解除檸檬酸和ATP對(duì)此酶的抑制。,一、檸檬酸積累的機(jī)制：,3、丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA和CO2固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸能力。 來(lái)路暢通 4、由于順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立以下平衡： 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸90：3：7 同時(shí)在控制Fe2+含量時(shí)，順烏頭酸水合酶活力低，使檸檬酸積累，一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制異檸檬酸脫氫酶活力、從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身積累。去路阻斷 5、檸檬酸的積累使pH值下降，在低pH值下，順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于檸檬酸的積累并排出體外。,