流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備

1、第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備 節(jié)概述待測標(biāo)本的制備是流式細(xì)胞術(shù)分析的關(guān)鍵，本節(jié)分別直接免疫熒光標(biāo)記、間接免疫熒光標(biāo)記、微量全血法免疫熒光標(biāo)記、雙標(biāo)記、培養(yǎng)細(xì)胞DNA熒光標(biāo)記以及細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備。知識點(diǎn)導(dǎo)航1.直接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備用標(biāo)有熒光素的特異抗體對細(xì)胞進(jìn)行直接染色，然后用流式細(xì)胞儀檢測，陽性者即表示有相應(yīng)抗原存在。實驗步驟如下：(1)每份取100 l單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約1106個細(xì)胞)。(2)一份加入相應(yīng)量的異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標(biāo)記的特異性熒光直標(biāo)單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗，作為陰性對照樣品。(3)室溫下避光反應(yīng)一定時間(時間長短根據(jù)試劑說明書要求進(jìn)行)，一般在室溫

2、下反應(yīng)1530min即可。(4)加入500 l磷酸緩沖液重懸成單細(xì)胞懸液即可上機(jī)檢測。2.間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備(1)取1106個細(xì)胞/100l，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應(yīng)30 min。(2)用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心沉淀棄掉上清液(離心轉(zhuǎn)數(shù)一般為8001000 r/min，5 min)。(3)用100 l PBS重懸細(xì)胞，再加入FITC或PE標(biāo)記熒光二抗(用量均按說明書要求加入)混勻，室溫下反應(yīng)30 min。(4)用PBS再洗滌細(xì)胞2次，加入500 l PBS重懸成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測。注意：以上兩種染色方法的抗體加入量和反應(yīng)時間，沒有非常具體的規(guī)定，一般應(yīng)根據(jù)試劑使用說明書的要求

3、進(jìn)行。若說明書上未說明，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)實驗，掌握好劑量與最佳反應(yīng)時間后，再進(jìn)行流式樣品的制備。制備好的樣品，若不能及時上機(jī)檢測，用14的多聚甲醛固定，4下可保存5d。3.微量全血法免疫熒光標(biāo)記的樣品制備目前制備全血細(xì)胞樣品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，然后進(jìn)行特異性熒光染色，其染色方法與前面介紹的方法相同。下面主要介紹與流式細(xì)胞儀配套的QPREP(免疫學(xué)樣品處理器)進(jìn)行快速制備微量全血樣品的方法：(1)微量全血直接熒光染色法：具體方法為取肝素或EDTA抗凝全血100 l置12 mm75 mm專用塑料試管中；每份加入20 l特異性熒光單抗，另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單

4、抗作陰性對照，室溫下避光染色15 min；置 Q PREP 儀上溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞，靜置5 min；上流式 細(xì)胞儀檢測。(2)微量全血間接熒光染色法：具體方法為取肝素或EDTA抗凝全血100 l置1275 mm專用塑料試管中；加入50 l特異的第一單克隆抗體，室溫下孵育30 min； 置QPREP儀上溶解紅細(xì)胞，穩(wěn)定和固定白細(xì)胞；離心(8001000 rpm，5 min)棄上清液，用PBS洗滌細(xì)胞2次；加入50 l熒光(FITC或PE)標(biāo)記的第二抗體，室溫下避光染色30 min；上流式細(xì)胞儀檢測。(3)注意事項：新鮮全血保存時間：一般室溫下放置8 h以內(nèi)可以使用，時間過長會使活性降低

5、，影響測定結(jié)果；抗凝血應(yīng)保證無血塊凝集；全血加入試管中時，應(yīng)盡量避免加到試管壁上，如沾到了管壁上必須用棉簽擦干凈，否則會影響細(xì)胞二維點(diǎn)圖的細(xì)胞群的分離效果。4.雙標(biāo)記(雙染色)直接免疫熒光的樣品制備在流式細(xì)胞術(shù)分析中，由于雙參數(shù)分析的光譜重疊現(xiàn)象和干擾因素相對增多，一般不采用間接熒光法制備細(xì)胞樣品而是用直接法進(jìn)行雙標(biāo)記染色。目前雙標(biāo)記的熒光探針較多，但一般采用FITC與PE標(biāo)記的單抗組合，在進(jìn)行雙標(biāo)記熒光染色的樣品制備中，由于前面已述及到熒光補(bǔ)償?shù)葐栴}，因此，不僅要制備陰性對照樣品，而且必須制備陽性對照樣品，以此先調(diào)整好流式細(xì)胞儀的工作參數(shù)，使測量得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。全血的樣品制備實驗步驟如下

6、：(1)取肝素或EDTA抗凝人外周血樣品100 l(2份)。(2)1份加入CD4FITC/CD8PE的雙標(biāo)熒光抗體；另一份加入MsIgG1FITC/MsIgG1PE鼠抗人無關(guān)單抗(作陰性對照)混勻。在室溫下避光染色15 min。(3)置QPREP樣品制備儀上，快速自動溶解紅細(xì)胞，穩(wěn)定和固定白細(xì)胞。(4)陽性對照樣品的制備，取100 l肝素抗凝正常人全血，加入CD4FITC/CD8PE雙標(biāo)熒光單抗，染色法與2、3步驟相同。(5)將制備好的樣品上流式細(xì)胞儀檢測。5.培養(yǎng)細(xì)胞DNA熒光染色的樣品制備(1)培養(yǎng)細(xì)胞用0.25的胰酶消化。(2)PBS或生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細(xì)胞，

7、加入預(yù)冷的無水乙醇，終濃度為(6070)，快速混勻，并用封口膜封口，置4下可保存15 d左右。(3)將固定過的細(xì)胞離心(8001000 r，5 min)棄上清液，再用PBS洗滌2次。(4)用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，每份為1106個細(xì)胞/100 l。(5)加入500 l DNA 熒光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色試劑盒)室溫下避光染色15 min。(6)上流式細(xì)胞儀檢測。以上樣品的制備可分析細(xì)胞周期各時相的百分比，同時可粗略觀察有無細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，如果用對照液(雞紅細(xì)胞)作參照標(biāo)準(zhǔn)，可進(jìn)行細(xì)胞DNA倍體分析。染色后的細(xì)胞在4可保存2 d，熒光強(qiáng)度保持不變。6.細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備(1

8、)懸浮細(xì)胞凋亡樣品的制備：使用 ANNEXIN VFITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，根據(jù)Annexin V與磷脂酰絲氨酸(含有碘化丙啶)的結(jié)合特性來檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。具體方法為： 將10的結(jié)合緩沖液用蒸餾水稀釋成為1倍稀釋，冰育；懸浮細(xì)胞在低溫環(huán)境中，用PBS洗滌細(xì)胞2次(8001000 r離心，5 min)；棄上清，加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(細(xì)胞濃度為105106ml)；加入5 l Annexin VFITC和5 l PI(碘化丙啶)于細(xì)胞懸浮液中，輕輕混勻； 將試管置于冰上，避光孵育10 min； 上FCM檢測。(2)貼壁細(xì)胞凋亡樣品的制備如下：24孔板每孔500 l培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。

9、根據(jù)實驗方案誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。加入5 l Annexin VFITC于含1.5 mmol/L CaCl2的細(xì)胞培養(yǎng)液中，037孵育10 min。收集細(xì)胞前用含1.5 mmol/L CaCl2的培養(yǎng)液洗滌2次。用Rubber policeman 收集細(xì)胞。用含1.5 mmol/L CaCl2培養(yǎng)液或1倍稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入終濃度為2.5 gml的PI(碘化丙啶)，輕輕混勻，置冰上孵育15 min。上流式細(xì)胞儀檢測。7.樣品制備應(yīng)注意的問題和影響因素(1)樣品制備應(yīng)注意的問題:單細(xì)胞懸液的制備是流式細(xì)胞術(shù)分析的關(guān)鍵，一般每份樣品要求的 細(xì)胞數(shù)為51051106。如遇有細(xì)胞團(tuán)塊應(yīng)先用30050

10、0目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，再上機(jī)檢測。用消化酶液消化細(xì)胞應(yīng)注意掌握酶的適當(dāng)濃度、溫度及pH值。免疫熒光標(biāo)本應(yīng)注意死細(xì)胞和碎片的去除，尤其是稀少細(xì)胞或細(xì)胞亞群的測定時，否則這些細(xì)胞的非特異性熒光增加，會干擾免疫熒光測定。對脫落細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，要慎重分析和解釋結(jié)果的生物學(xué)意義，因為這些結(jié)果常出現(xiàn)陰性或假陽性結(jié)果，這是由于其中的白細(xì)胞常有變性。因此，要求每份樣品中雜質(zhì)、碎片、團(tuán)塊重疊細(xì)胞應(yīng)在20以下，對腫瘤細(xì)胞DNA異倍體的樣品分析，至少應(yīng)有20的腫瘤細(xì)胞存在(占主峰1/5以上的異倍體才可確認(rèn)為異倍體峰)。(2)影響樣品制備的因素:溫度對熒光強(qiáng)度的影響：一般認(rèn)為，溫度升高時熒光減弱，所以在熒光測量時要保持染色后的樣品在適當(dāng)?shù)蜏丨h(huán)境下進(jìn)行，并盡可能減少樣品的光照射時間。有條件時，應(yīng)使樣品觀察室達(dá)到恒溫，使溫