



下載本文檔
版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進(jìn)行舉報或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、第二節(jié)流式細(xì)胞術(shù)的樣品制備 節(jié)概述待測標(biāo)本的制備是流式細(xì)胞術(shù)分析的關(guān)鍵,本節(jié)分別直接免疫熒光標(biāo)記、間接免疫熒光標(biāo)記、微量全血法免疫熒光標(biāo)記、雙標(biāo)記、培養(yǎng)細(xì)胞DNA熒光標(biāo)記以及細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備。知識點(diǎn)導(dǎo)航1.直接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備用標(biāo)有熒光素的特異抗體對細(xì)胞進(jìn)行直接染色,然后用流式細(xì)胞儀檢測,陽性者即表示有相應(yīng)抗原存在。實驗步驟如下:(1)每份取100 l單細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度約1106個細(xì)胞)。(2)一份加入相應(yīng)量的異硫氰酸熒光素或藻紅蛋白標(biāo)記的特異性熒光直標(biāo)單抗,另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單抗,作為陰性對照樣品。(3)室溫下避光反應(yīng)一定時間(時間長短根據(jù)試劑說明書要求進(jìn)行),一般在室溫
2、下反應(yīng)1530min即可。(4)加入500 l磷酸緩沖液重懸成單細(xì)胞懸液即可上機(jī)檢測。2.間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備(1)取1106個細(xì)胞/100l,先加入一抗混勻,置室溫下避光反應(yīng)30 min。(2)用PBS洗滌細(xì)胞2次,離心沉淀棄掉上清液(離心轉(zhuǎn)數(shù)一般為8001000 r/min,5 min)。(3)用100 l PBS重懸細(xì)胞,再加入FITC或PE標(biāo)記熒光二抗(用量均按說明書要求加入)混勻,室溫下反應(yīng)30 min。(4)用PBS再洗滌細(xì)胞2次,加入500 l PBS重懸成單細(xì)胞懸液,上機(jī)檢測。注意:以上兩種染色方法的抗體加入量和反應(yīng)時間,沒有非常具體的規(guī)定,一般應(yīng)根據(jù)試劑使用說明書的要求
3、進(jìn)行。若說明書上未說明,應(yīng)先進(jìn)行預(yù)實驗,掌握好劑量與最佳反應(yīng)時間后,再進(jìn)行流式樣品的制備。制備好的樣品,若不能及時上機(jī)檢測,用14的多聚甲醛固定,4下可保存5d。3.微量全血法免疫熒光標(biāo)記的樣品制備目前制備全血細(xì)胞樣品的方法很多,且很成熟,常用的方法是用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞,然后進(jìn)行特異性熒光染色,其染色方法與前面介紹的方法相同。下面主要介紹與流式細(xì)胞儀配套的QPREP(免疫學(xué)樣品處理器)進(jìn)行快速制備微量全血樣品的方法:(1)微量全血直接熒光染色法:具體方法為取肝素或EDTA抗凝全血100 l置12 mm75 mm專用塑料試管中;每份加入20 l特異性熒光單抗,另一份加入熒光標(biāo)記的無關(guān)單
4、抗作陰性對照,室溫下避光染色15 min;置 Q PREP 儀上溶解紅細(xì)胞、穩(wěn)定和固定白細(xì)胞,靜置5 min;上流式 細(xì)胞儀檢測。(2)微量全血間接熒光染色法:具體方法為取肝素或EDTA抗凝全血100 l置1275 mm專用塑料試管中;加入50 l特異的第一單克隆抗體,室溫下孵育30 min; 置QPREP儀上溶解紅細(xì)胞,穩(wěn)定和固定白細(xì)胞;離心(8001000 rpm,5 min)棄上清液,用PBS洗滌細(xì)胞2次;加入50 l熒光(FITC或PE)標(biāo)記的第二抗體,室溫下避光染色30 min;上流式細(xì)胞儀檢測。(3)注意事項:新鮮全血保存時間:一般室溫下放置8 h以內(nèi)可以使用,時間過長會使活性降低
5、,影響測定結(jié)果;抗凝血應(yīng)保證無血塊凝集;全血加入試管中時,應(yīng)盡量避免加到試管壁上,如沾到了管壁上必須用棉簽擦干凈,否則會影響細(xì)胞二維點(diǎn)圖的細(xì)胞群的分離效果。4.雙標(biāo)記(雙染色)直接免疫熒光的樣品制備在流式細(xì)胞術(shù)分析中,由于雙參數(shù)分析的光譜重疊現(xiàn)象和干擾因素相對增多,一般不采用間接熒光法制備細(xì)胞樣品而是用直接法進(jìn)行雙標(biāo)記染色。目前雙標(biāo)記的熒光探針較多,但一般采用FITC與PE標(biāo)記的單抗組合,在進(jìn)行雙標(biāo)記熒光染色的樣品制備中,由于前面已述及到熒光補(bǔ)償?shù)葐栴},因此,不僅要制備陰性對照樣品,而且必須制備陽性對照樣品,以此先調(diào)整好流式細(xì)胞儀的工作參數(shù),使測量得到的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。全血的樣品制備實驗步驟如下
6、:(1)取肝素或EDTA抗凝人外周血樣品100 l(2份)。(2)1份加入CD4FITC/CD8PE的雙標(biāo)熒光抗體;另一份加入MsIgG1FITC/MsIgG1PE鼠抗人無關(guān)單抗(作陰性對照)混勻。在室溫下避光染色15 min。(3)置QPREP樣品制備儀上,快速自動溶解紅細(xì)胞,穩(wěn)定和固定白細(xì)胞。(4)陽性對照樣品的制備,取100 l肝素抗凝正常人全血,加入CD4FITC/CD8PE雙標(biāo)熒光單抗,染色法與2、3步驟相同。(5)將制備好的樣品上流式細(xì)胞儀檢測。5.培養(yǎng)細(xì)胞DNA熒光染色的樣品制備(1)培養(yǎng)細(xì)胞用0.25的胰酶消化。(2)PBS或生理鹽水洗滌細(xì)胞2次,再用PBS或生理鹽水懸浮細(xì)胞,
7、加入預(yù)冷的無水乙醇,終濃度為(6070),快速混勻,并用封口膜封口,置4下可保存15 d左右。(3)將固定過的細(xì)胞離心(8001000 r,5 min)棄上清液,再用PBS洗滌2次。(4)用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度,每份為1106個細(xì)胞/100 l。(5)加入500 l DNA 熒光染料(通常用Coulter公司提供的DNA染色試劑盒)室溫下避光染色15 min。(6)上流式細(xì)胞儀檢測。以上樣品的制備可分析細(xì)胞周期各時相的百分比,同時可粗略觀察有無細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,如果用對照液(雞紅細(xì)胞)作參照標(biāo)準(zhǔn),可進(jìn)行細(xì)胞DNA倍體分析。染色后的細(xì)胞在4可保存2 d,熒光強(qiáng)度保持不變。6.細(xì)胞凋亡檢測樣品的制備(1
8、)懸浮細(xì)胞凋亡樣品的制備:使用 ANNEXIN VFITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,根據(jù)Annexin V與磷脂酰絲氨酸(含有碘化丙啶)的結(jié)合特性來檢測細(xì)胞凋亡發(fā)生的情況。具體方法為: 將10的結(jié)合緩沖液用蒸餾水稀釋成為1倍稀釋,冰育;懸浮細(xì)胞在低溫環(huán)境中,用PBS洗滌細(xì)胞2次(8001000 r離心,5 min);棄上清,加入預(yù)冷的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞(細(xì)胞濃度為105106ml);加入5 l Annexin VFITC和5 l PI(碘化丙啶)于細(xì)胞懸浮液中,輕輕混勻; 將試管置于冰上,避光孵育10 min; 上FCM檢測。(2)貼壁細(xì)胞凋亡樣品的制備如下:24孔板每孔500 l培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。
9、根據(jù)實驗方案誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。加入5 l Annexin VFITC于含1.5 mmol/L CaCl2的細(xì)胞培養(yǎng)液中,037孵育10 min。收集細(xì)胞前用含1.5 mmol/L CaCl2的培養(yǎng)液洗滌2次。用Rubber policeman 收集細(xì)胞。用含1.5 mmol/L CaCl2培養(yǎng)液或1倍稀釋的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。加入終濃度為2.5 gml的PI(碘化丙啶),輕輕混勻,置冰上孵育15 min。上流式細(xì)胞儀檢測。7.樣品制備應(yīng)注意的問題和影響因素(1)樣品制備應(yīng)注意的問題:單細(xì)胞懸液的制備是流式細(xì)胞術(shù)分析的關(guān)鍵,一般每份樣品要求的 細(xì)胞數(shù)為51051106。如遇有細(xì)胞團(tuán)塊應(yīng)先用30050
10、0目的細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后,再上機(jī)檢測。用消化酶液消化細(xì)胞應(yīng)注意掌握酶的適當(dāng)濃度、溫度及pH值。免疫熒光標(biāo)本應(yīng)注意死細(xì)胞和碎片的去除,尤其是稀少細(xì)胞或細(xì)胞亞群的測定時,否則這些細(xì)胞的非特異性熒光增加,會干擾免疫熒光測定。對脫落細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液,要慎重分析和解釋結(jié)果的生物學(xué)意義,因為這些結(jié)果常出現(xiàn)陰性或假陽性結(jié)果,這是由于其中的白細(xì)胞常有變性。因此,要求每份樣品中雜質(zhì)、碎片、團(tuán)塊重疊細(xì)胞應(yīng)在20以下,對腫瘤細(xì)胞DNA異倍體的樣品分析,至少應(yīng)有20的腫瘤細(xì)胞存在(占主峰1/5以上的異倍體才可確認(rèn)為異倍體峰)。(2)影響樣品制備的因素:溫度對熒光強(qiáng)度的影響:一般認(rèn)為,溫度升高時熒光減弱,所以在熒光測量時要保持染色后的樣品在適當(dāng)?shù)蜏丨h(huán)境下進(jìn)行,并盡可能減少樣品的光照射時間。有條件時,應(yīng)使樣品觀察室達(dá)到恒溫,使溫
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 教育科技融合啟航盛典見證新高度
- 全球鈾礦資源分布與核能產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)升級路徑研究報告
- 公交優(yōu)先戰(zhàn)略2025年城市交通擁堵治理的公共交通與城市社區(qū)建設(shè)協(xié)同報告
- ChEMBL22003-生命科學(xué)試劑-MCE
- 浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院《核醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 甘肅省武威五中學(xué)2025屆化學(xué)九上期末檢測模擬試題含解析
- 廣東信息工程職業(yè)學(xué)院《行為矯正學(xué)》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 2024-2025學(xué)年江蘇省南京市鼓樓區(qū)鼓樓實驗中學(xué)七年級數(shù)學(xué)第一學(xué)期期末經(jīng)典模擬試題含解析
- 江西師范高等專科學(xué)?!度诤峡臻g設(shè)計》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 廣州華南商貿(mào)職業(yè)學(xué)院《概率論與數(shù)理統(tǒng)計》2023-2024學(xué)年第一學(xué)期期末試卷
- 無人飛機(jī)農(nóng)業(yè)植保應(yīng)用技術(shù) 課件17、極飛P40農(nóng)業(yè)無人飛機(jī)作業(yè)-3
- 呼吸病區(qū)進(jìn)修管理制度
- 足浴轉(zhuǎn)讓合同協(xié)議書
- 2024年國能榆林化工有限公司招聘真題
- 消防總隊面試題目及答案
- 《低鈉血癥中國專家共識(2023年版)》解讀課件
- 2022-2023學(xué)年山東省濟(jì)寧市兗州區(qū)人教版四年級下冊期末考試數(shù)學(xué)試卷(原卷版)
- GB/T 45604-2025船舶與海洋技術(shù)大抓力平衡錨
- 國家中小學(xué)智慧教育平臺與人工智能融合應(yīng)用指南(試行)
- 新課程標(biāo)準(zhǔn)視角下項目式學(xué)習(xí)在中小學(xué)的有效實施途徑
- 1.1中華人民共和國成立前各種政治力量 課件高中政治統(tǒng)編版必修三政治與法治
評論
0/150
提交評論