艾滋病梅毒丙肝的檢測及解釋參考幻燈片.ppt

1、HIV、TP、HCV的檢驗及意義,1,HIV實驗室檢測,2,檢測樣本,HIV抗體 酶免-血清/血漿，尿液 快速檢測-血清/血漿/全血，唾液 CD4：抗凝全血 病載、基因型、耐藥：血漿,3,樣本保存,抗體檢測：短期（1周）內進行檢測的可存放于28， 一周以上應存放于-20以下。 篩查陰性樣品，建議至少保存12個月； 篩查陽性樣品，無論確證結果如何，均應將剩余的樣品保存至少10年 核酸檢測：血漿4天內進行檢測的可存放于4，3個月以內應存放于-20以下，3個月以上應置于-70以下。 CD4：室溫（1825）保存和運輸。要求48小時內染色，染色后6小時內分析；如采血后24小時內染色，可在染色后24小時

2、內分析。,4,HIV抗體檢測,篩查試驗 酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 化學發(fā)光或免疫熒光試驗 快速檢測（RT） 確證試驗 免疫印跡試驗（WB） 條帶免疫試驗 放射免疫沉淀試驗（RIPA） 免疫熒光試驗（IFA）,5,初篩和復檢流程,6,確證流程,7,質量控制,試劑盒內部對照 ：按照試劑盒要求設置 使用室內質控品：外購、陽性對照/樣本稀釋 ELISA檢測 20次內即刻法質控 20次后， Levey-Jennings質控圖 更換試劑廠家必須重新制作質控圖， 同種試劑不同批號可繼續(xù)使用（注明批號） 發(fā)現失控、位移及時查找原因，必要時重新開始質控 快速檢測 更換批號進行質量驗證 注意反應時間、溫度、

3、數量控制,8,設備檢定、維護,強檢設備 酶標儀、移液器、高壓鍋、溫度計（可自行比對） 自行維護 生物安全柜、洗板機、洗眼器、水平（梅毒）旋轉儀 溫度控制 冰箱、溫箱/水浴箱內放置經檢定（比對）的溫度計 高壓滅菌放置指示卡 洗眼器定期進行維護,9,SOP文件,（1）樣品的接收、登記、處理、保存和運輸； （2）檢測方法和步驟； （3）試劑使用和保存； （4）儀器的使用維護和校準； （5）質量控制要求及程序； （6）結果解釋與報告； （7）保密程序； （8）實驗室數據、相關文件記錄與保存； （9）不確定樣品追蹤和處理； （10）實驗室安全防護及實驗室的清理和消毒。,10,實驗室記錄,檢測登記表 試驗

4、原始記錄（ ELISA、快速、RPR/TURST ） 報告單/化驗單 復檢化驗單篩查陽性填寫，信息收集完整 儀器使用、維護保養(yǎng)記錄 質控資料 消毒記錄 廢棄物處理登記 冰箱溫度記錄 人員健康檔案（體檢、疫苗接種記錄，化驗單、體檢報告）,11,實驗室生物安全,實驗室：級生物安全實驗室（BSL-2） 建立安全制度：S-SOP、意外事故處理預案、信息安全及保密制度 培訓和管理：全員培訓、標準防護原則 個人防護：防護用品與設施、健康監(jiān)護 安全操作：樣品采集與管理、儀器設備使用、利器使用 消費與污物處理,12,梅毒實驗室檢測技術,13,梅毒螺旋體-梅毒的病原體分類：,螺旋體目（Spirochaetale

5、s） 螺旋體科（Spirochaetaceae） 密螺旋體屬（Treponema） 蒼白螺旋體種（Treponema pallidum） 分幾個亞種,14,梅毒螺旋體（TP）,小而纖細的螺旋狀微生物 長520m，粗細0.2m 有6 12個規(guī)則的螺旋 基本結構為一原生質的圓柱體，為兩層膜所圍繞 行動緩慢而有規(guī)律 - 圍繞其長軸旋轉中前后移動 - 伸縮其圈間之距離而移動 - 全身彎曲如蛇行,15,生物學特性-1,免疫性：人對TP產生細胞免疫和體液免疫。細胞免疫對感染過程的影響尚不清楚。 特異性抗體：TP可導致人體產生多種抗體。其中 TP的脂質激發(fā)機體產生的特異性抗體，在初次感染后產生，保持終生，但

6、對清除機體內的TP無作用。另一些種特異性抗體可與很多種非致病性螺旋體發(fā)生交叉反應。,16,生物學特性-2,反應素：TP破壞機體組織，使組織釋放一種抗原性心磷脂,以及螺旋體自身的磷脂類物質，可以激發(fā)機體產生反應素，能同從動物如牛心肌中提取的心磷脂發(fā)生反應，通過試驗來檢測。 反應素水平與梅毒感染過程相平行，抗梅治療后約半年轉陰，但反應素并非感染TP后所特有。,17,生物學特性-3,致病性：自然條件下TP只感染人，尚未證明梅毒螺旋體能產生內毒素和外毒素，致病機理尚不清楚。 傳染性：感染早期傳染性最強，隨著病程的延長傳染性越來越小。臨床上未經治療的病人，在感染后12年內最具有傳染性，一般認為4年以上幾

7、乎不通過性接觸傳染，但保持對胎兒的傳染性。 抵抗力：TP在體外僅能存活數小時，40時失去傳染力，煮沸立即死亡；對干燥特別敏感，一般的消毒劑均能容易將其殺滅。血庫的血液和血漿中可存活24小時以上，三日后全部死亡。,18,生存條件,厭氧寄生物，在人體內可長期生存，體外不易存活 干燥、肥皂水及一般消毒劑如1:1000苯酚、新潔爾滅、酒精均可于短時間將其殺死 在血液中4經3日可死亡，故在血庫冰箱冷藏3日以上的血液就無傳染性 溫度的影響：41-42時可生活1-2小時，在48僅半小時即失去感染力，100立即死亡。對寒冷抵抗力強，在0時，可生活48小時，如將梅毒病損標本置于冰箱內，經1周仍可致病。在低溫（-

8、78）保存數年，仍可保持其形態(tài)、活動及毒性 在封存的生理鹽水稀釋的組織液中可生活10小時左右 在潮濕的器具或濕毛巾中，亦可生存數小時 在干燥環(huán)境中可見迅速死亡,19,宿 主,梅毒螺旋體只感染人類 人是梅毒的唯一傳染源,20,傳播途徑,性接觸是主要的傳染途徑 未經治療的患者在感染后的1年內最具有傳染性 隨著病期的延長，傳染性越來越小 到感染后4年，通過性接觸一般無傳染性 母 嬰 傳 播 在妊娠7周時，梅毒螺旋體即可通過胎盤傳染（未經治療者），病期4年雖已無性傳播，但妊娠時仍可傳染給胎兒,病期越長，傳染性越小;,21,常用梅毒實驗室檢測方法,病原學檢測 血清學檢測,22,病原學檢查,原理：一期、二

9、期梅毒時，取硬下疳、扁平濕疣、黏膜斑等皮損部位組織液或淋巴結穿刺術得到的組織液，在暗視野顯微鏡下，光線從聚光器的邊緣斜射到涂片上的梅毒螺旋體而發(fā)出亮光，從而可根據其特殊形態(tài)和運動方式進行檢測。 方法：（1）暗視顯微鏡檢查 （2）鍍銀染色法 （3）核酸檢測（血液標本？） 注：梅毒螺旋體目前體外人工培養(yǎng)還沒有獲得成功，僅能通過接種兔睪丸等部位進行有限增殖。,23,病原學檢查的臨床意義,螺旋體檢查是診斷早期梅毒的最佳方法，對于患者的早期診斷、及時治療、預后和盡早切斷傳染源都有十分重要的意義。 如未見到梅毒螺旋體，并不能排除患梅毒的可能性。,24,梅毒血清學檢測方法,(1) 非梅毒螺旋體抗原血清學試驗

10、 （非特異性梅毒抗體） (2) 梅毒螺旋體抗原血清學試驗 （特異性梅毒抗體）兩類方法。 問題： 為什么梅毒診斷需要上述兩類血清學檢測方法？,25,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,梅毒螺旋體一旦感染人體，宿主可對螺旋體表面的脂質作出免疫應答，產生抗類脂抗原的抗體（非特異性抗體）。 未經治療的病人，其血清內的非特異性抗體可長期存在。經正規(guī)治療后，非特異性抗體可以逐漸減少滴度至轉為陰性。 問題： 臨床上非梅毒螺旋體抗原血清學試驗為什么需要做定性和定量兩種檢測方法？,26,非梅毒螺旋體抗原血清學原理,方法包括： （1）快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗 (RPR) （2）甲苯胺紅不加熱血清試驗（TRUST）

11、（3）性病研究實驗室試驗 (VDRL)等。 基本成分是心磷脂 卵磷脂和膽固醇 抗原抗體結合形成復合物，凝集成網狀沉淀顆粒被肉眼所見 上述方法的敏感性和特異性都基本相似,27,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理示意圖,28,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉儀，轉速？轉幅？,2、定性試驗 加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內 加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原 反應：水平旋轉儀旋轉8分鐘(23 -29 ） ，亮光下觀察結果,？滴/mL，1滴=？ul,29,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,1、儀器：水平旋轉儀，轉速、轉幅,2、定性試驗

12、 加樣：吸取0.05mL血清(漿)放在卡片圈中， 并均勻地涂布在整個圈內 加抗原：將抗原輕輕搖勻，用9號針頭加1滴抗原 反應：水平旋轉儀旋轉8分鐘(23 -29 ） ，亮光下觀察結果,60滴/mL，1滴=17ul,100r/min 約18mm,30,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,3、定量試驗 稀釋夜準備：在反應紙板圈內加入50uL生理鹽水（根據需要確定圈數),勿將鹽水涂開 加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內。 下同定性試驗。,？,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,問題：定量試驗原倍血清滴度是多少？,問

13、題：定量試驗血清稀釋需要使用試管嗎？,31,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗操作要點,3、定量試驗 稀釋夜準備：在反應紙板圈內加入50uL生理鹽水（根據需要確定圈數),勿將鹽水涂開 加樣：吸取50uL血清（漿）與各圈中鹽水作系列稀釋，并涂布整個圈內。 下同定性試驗。,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:256,1:128,1:512,32,TRUST 1:16,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗結果判斷,RPR 1:256,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:1,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,1:256,1:512,1:32,1:6

14、4,1:128,1:256,1:512,33,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗臨床意義,早期梅毒（一期、二期）經足量規(guī)則抗梅毒治療后 一期梅毒1年后轉為陰性 二期梅毒2年后轉為陰性。 晚期梅毒 治療后血清滴度下降緩慢，2年后約50%病人血清反應仍為陽性。,34,非梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,非梅毒螺旋體抗原血清試驗方法簡單、快速、敏感性和特異性較好。適用于大量人群的篩查。 因治療后血清滴度可下降并陰性，故可作為療效觀察、判愈、復發(fā)或再感染的指征。,35,非梅毒螺旋體抗原血清學試驗特點,假陽性反應 技術性假陽性反應一般是由于操作錯誤引起的假陽性反應，經過重復試驗即可排除。 生物學假陽性反應(一般滴

15、度小于1:8），應采用梅毒螺旋體抗原血清學試驗如TPPA等進行排除。 假陰性反應：前帶現象、后帶現象 血清固定：臨床問題,36,梅毒螺旋體抗原血清學試驗原理,抗原為梅毒螺旋體特異蛋白（包括螺旋體重組特異抗原），檢測梅毒患者血中特異性抗梅毒螺旋體抗原的抗體。 感染梅毒螺旋體后，一旦梅毒螺旋體抗體試驗呈陽性，則患者終身陽性。 問題：梅毒螺旋體抗原血清學試驗的定量試驗在梅毒診療中有意義嗎？,37,梅毒螺旋體抗原血清學試驗方法,梅毒螺旋體顆粒凝集試驗 (TPPA) 梅毒螺旋體血球凝集試驗 (TPHA) 梅毒酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 化學發(fā)光免疫分析法（CLIA） 梅毒免疫層析法-梅毒快速檢測 (

16、RT) 熒光螺旋體抗體吸收試驗（FTA-ABS） 梅毒螺旋體蛋白印跡試驗（WB）,38,TPPA,TPPA試驗用梅毒螺旋體致敏明膠顆粒與人血清中的抗梅毒螺旋體抗體結合，產生可見的凝集反應，具有較高的敏感性和特異性。 TPPA是目前WHO公認的梅毒抗原血清學試驗的“金標準”，常用于新方法、新試劑的參照標準。,39,+,明膠顆粒,梅毒抗原,+,抗原致敏顆粒,抗原致敏顆粒,血液中抗體,抗原抗體凝集,TPPA試驗原理示意圖,40,41,4+： 粒子光滑覆蓋整個孔底，有時邊緣有折疊 3+： 粒子光滑覆蓋大部分底 2+：粒子光滑聚集覆蓋孔底，周圍有一細胞環(huán) 1+： 粒子光滑集聚覆概孔底，周圍有一明顯細胞環(huán)

17、 ： 粒子沉集孔底，中央形成一小點 ： 粒子緊密沉積孔底中央,TPPA試驗結果判讀,a:均為RPR陽性標本,41,ELISA/ CLIA,ELISA試驗是用重組梅毒螺旋體抗原包被固相板條，加上梅毒血清和單克隆抗體酶標記物，形成抗原抗體復合物與酶標記物結合，用酶聯檢測儀判定試驗陽性反應。 本法可用于大樣本血清檢測。 化學發(fā)光法的臨床應用意義基本同ELISA 化學發(fā)光法的敏感性？,42,梅毒免疫層析快速檢測方法（全血法）,43,梅毒免疫層析快速檢測方法（血清、血漿法）,44,梅毒螺旋體抗原血清試驗臨床意義,作為非梅毒螺旋體抗原血清試驗(如RPR等)初篩陽性標本的確證試驗，排除RPR 假陽性。 不能

18、區(qū)分既往感染和現癥感染，應結合非梅毒螺旋體抗原血清試驗結果進行診斷。 不能作為療效觀察的指標。,45,梅毒血清學試驗結果解釋（梅毒臨床診斷參考依據）,問題：此結果解釋適用于先天（胎傳）梅毒嗎？,46,先天（胎傳）梅毒的實驗室診斷 預防艾滋病、梅毒和乙肝母嬰傳播工作實施方案,47,梅毒暴露嬰兒的評估,梅毒暴露嬰兒： 嬰兒RPR檢測不能使用臍帶血，因其易被母體血液污染，從而出現假陽性結果 檢查先天梅毒臨床表現：非免疫性水腫、黃疸、肝脾大、鼻炎、皮疹、末端肢體假性麻痹 對可疑病灶或體液進行暗視野顯微鏡檢查,48,先天梅毒的實驗室檢測,梅毒暴露嬰兒： 暗視野顯微鏡檢梅毒螺旋體陽性 梅毒螺旋體IgM抗體

19、陽性* RPR/TRUST檢測陽性，滴度比母親分娩前最近一次滴度高4倍及以上 RPR/TRUST監(jiān)測隨訪中，任何一次滴度不下降或反而上升 滿18月齡后， TPPA檢測陽性（哪一類抗體？）,* IgM抗體反映近期感染，可幫助鑒別嬰兒先天梅毒,49,梅毒IgM抗體（TP-IgM）,IgM抗體的產生是感染后的早期體液免疫應答反應。IgM分子比IgG較大，所以IgM抗體不能通過胎盤屏障。而母親的IgG抗體可以通過胎盤屏障傳給胎兒。因此若在新生兒血中檢測到IgG抗體不能作為先天梅毒的診斷依據，而IgM抗體可為先天梅毒的診斷依據。 IgM抗體檢測其特異性較高，IgM抗體反映近期感染，可幫助鑒別嬰兒先天梅毒

20、。但敏感性較低，因此，IgM抗體檢測陰性，不能排除先天梅毒感染。,50,先天梅毒檢測流程,51,梅毒實驗室檢測策略思考,方法選擇依據 敏感性、特異性（試劑評估） 操作流程（可及性） 試劑的價格、結果時間（可接收性） 根據目的選擇檢測方法及檢測策略。 可采用任何一類梅毒血清學檢測方法作為篩查試驗。,？初篩目的和方法選擇,52,53,54,陽性,54,血清學檢測試劑的種類,55,HCV的檢測及意義,56,丙型病毒性肝炎為法定傳染性疾病。,57,Alberti, J Hepatol 1999; 31: 17-24 Seef, Hepatology 2002; 36: S35-46 Fan et al

21、, World J Gastroenterol 2004; 10: 2867-2869,在全球，丙肝是死亡率第十的傳染性疾病 在中國，丙肝是死亡率第五的傳染性疾病,丙肝： 高危害,通常為沉默感染，人體感染HCV20年、或更長時間無任何癥狀表現。,58,丙肝：無預防性疫苗，但可治愈,丙肝疾病將是中國的沉重經濟負擔: 1170-2160億元/ 年 乙型肝炎疫苗的推廣，新感染病例顯著下降；由于丙型肝炎缺乏有效的預防性疫苗，有可能成為影響人民健康的主要肝臟疾病 我國首部丙肝防治指南所指出的，通過聚乙二醇干擾素+利巴韋林，使用足夠劑量治療一年，丙肝的治愈率可以達到七、八成左右，這也是目前國際上丙肝治療的

22、最佳方案。,Ghany M, et al. Hepatology 2009; 49: 133574,59,60,中國丙肝臨床早期篩查亟待加強,中國疾病預防控制中心公共衛(wèi)生監(jiān)測與信息服務中心，施小明, 等. 疾病監(jiān)測 2006; 21: 493.,185/358,465/1826,100/432,數據源自國內30個省(自治區(qū)、直轄市)共250家醫(yī)療機構，采樣15501例，有效樣本13714例,丙肝是中國漏報率最高的法定傳染病,61,假陰性和假陽性是困惑抗HCV檢測的主要問題,間接法自身的缺陷可能出現假陽性和IgM的漏檢。采用第2代(Abbott)和第3代(Ortho)EIA試劑，假陽性率可達30

23、% 抗原位點的選擇以及抗原的純化是影響檢測靈敏度和特異性的重要因素； SLE, RA，某些感染性疾病等引起高濃度的免疫球蛋白造成假陽性（RF的干擾；高濃度非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上） SOD超氧化歧化酶干擾 廠家之間的靈敏度和特異性存在著一定差異，從而導致抗-HCV檢測結果不一致； 同一廠家的不同批試劑間亦會有較大差異。,62,采用間接ELISA法檢測抗體是評估HCV感染的初篩手段 HCV特異性抗體陽性反映了患者體內病毒存在，一旦抗HCV陽性，終生難以轉陰。 HCV抗體檢測的雙抗原夾心ELISA法 HCV抗原檢測方法的建立 HCV的RNA和抗原在患者體內呈間歇陽性； 病毒基

24、因型復雜易變異，基因水平的檢測質量不夠穩(wěn)定； 重組免疫印跡實驗（RIBA）被認為是HCV監(jiān)測的金標準。,必須規(guī)范HCV實驗檢測評估和報告體系,63,Chiron公司推出了相應的確認實驗重組免疫印跡實驗（RIBA）。 RIBA被認為是HCV抗體檢測的“金標準”。HCV抗體檢測結果不一致的標本，使用確認試劑檢測。 至少2條HCV特異性條帶且為1+的條帶反應模式判讀為陽性結果。陰性為無HCV特異性反應條帶。,Recombinant immunoblot assay (RIBA),Other tests such as Matrix HCV 2.0(Abbott), Liatek-III (Organ

25、on), Inno-Lia HCV Ab III (Innogenetics), Murex Western blot (Abbott), Deciscan HCV Plus (Bio-Rad) and HCV blot 3.0 (Genelabs),RIBA被認為是HCV抗體檢測的“金標準”。,64,HCV Blot 3.0（ MP，麗珠）（18/36T）,GST質控帶,注：1，2，3為陽性樣本 4為陰性樣本,萬泰HCV RIBA試劑 （24T）,65,幾個月前報告“陽性”，目前報告“陰性”？ 臨界值標本、弱陽性標本，如何處理？ 產婦發(fā)現抗-HCV陽性，可以哺乳嗎？ 無輸血及血制品史 偶爾在

26、外治療牙病 三家醫(yī)院結果為什么不一致？ A院“S/CO3.5”，B院“弱陽”，C院“陰性” 老人內鏡術后檢查抗-HCV陽性，惹上麻煩？,問題舉例,66,結果“時（-）時（+）”,ELISA（+）、膠體金（-）”,67,醫(yī)院檢測（-）、而血站檢測（+）”,嬰幼兒結果“（弱+）”,68,某方法孕婦多次出現“（假+）”,并非僅僅是孕婦出現“（假+）”,69,對于不是很強的“（+）”結果的處理,出現“（+）”結果時的處理方式,70,遇見這樣的事情，您不困惑？,71,二、丙型肝炎病毒實驗室檢測中的策略,72,丙型肝炎病毒實驗室檢測技術規(guī)范2011年9月20日頒布實施,起草單位： 中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心 使用范圍： 全國所有的丙型肝炎病毒檢測實驗室 解釋權： 中國疾病預防控制中心 實施： 衛(wèi)生部授權，中國疾病預防控制中心發(fā)布實施,73,在臨床診斷中規(guī)定了HCV抗體篩查陽性反應后必須進行補充實驗（免疫印跡或核酸檢測） 在臨床診斷中引入S/CO比值的使用 明確了丙肝檢測實驗室質量控制,74,基本原則,1.對于篩查試驗陰性樣品，不需要做進一步檢測，可報告“抗HCV陰性” 2.對于篩查試驗陽性樣品，可選擇S/CO比值進行補充試驗，或非S/CO比值的補充試驗 a. 高比值，可報告“抗HCV陽性”，不需要做補充試驗；低比值，應